邱天文　朱紅梅　溫海

(上海市長征醫(yī)院皮膚科 上海市醫(yī)學真菌分子生物學重點實驗室，上海 200003)

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·綜述·

隱球菌侵襲血腦屏障相關(guān)機制研究進展

邱天文朱紅梅溫海

(上海市長征醫(yī)院皮膚科 上海市醫(yī)學真菌分子生物學重點實驗室，上海 200003)

隱球菌是一種環(huán)境機會致病菌，能夠侵襲宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)并引起致命性的隱球菌性腦膜腦炎。在隱球菌侵犯血腦屏障過程中，有許多重要的致病因素參與，如莢膜、尿素酶、磷脂酶等。其還可以通過多種途徑穿越血腦屏障，造成腦部感染。近年來發(fā)現(xiàn)隱球菌還可以利用纖溶酶激活基質(zhì)金屬蛋白酶類，使其穿越血腦屏障。該文就隱球菌侵襲血腦屏障的相關(guān)機制研究進展作一綜述。

隱球菌；血腦屏障；基質(zhì)金屬蛋白酶；MMP-9

隱球菌是一種環(huán)境腐生菌，廣泛存在于環(huán)境和被鴿糞污染的土壤中。它易侵犯免疫缺陷人群，但最新研究表明隱球菌也能感染免疫正常的人群。隱球菌有強烈的嗜中樞特點[1]，其能利用多種方式侵襲人腦的血腦屏障，逃脫和麻痹宿主免疫監(jiān)視，進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)嚴重和致命的隱球菌性腦膜腦炎[2]。隱球菌性腦膜腦炎目前還沒有非常好的特效藥物治療，死亡率很高。據(jù)有關(guān)專家的研究統(tǒng)計，全球每年大約有100萬人新增感染隱球菌性腦膜炎，死亡60萬以上[3]。據(jù)現(xiàn)有研究報道，隱球菌在侵入宿主的過程中，隱球菌和宿主兩方面的多重因素參與了該過程的發(fā)生：隱球菌自身結(jié)構(gòu)的莢膜多糖、尿素酶，透明質(zhì)酸等其他毒力因子都能夠共同促進隱球菌對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染；而“木馬機制”“跨細胞內(nèi)皮途徑”“細胞旁途徑”等都在隱球菌侵襲宿主過程中起重要作用。近年來，很多學者發(fā)現(xiàn)，隱球菌在侵襲宿主血腦屏障時，宿主體內(nèi)的基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的MMP-9等金屬蛋白酶會被激活，使隱球菌更易穿過血腦屏障。

1　隱球菌侵襲血腦屏障的因素和途徑

1.1隱球菌的致病因素

莢膜莢膜是隱球菌主要的致病因素，莢膜上的葡萄糖醛酰木糖基甘露聚糖 (GXM)和半乳糖木糖甘露聚糖 (GalXM)在逃脫宿主免疫監(jiān)視和吞噬中起到特殊作用。有關(guān)研究顯示，缺少莢膜的隱球菌，相比具有莢膜的菌株，其侵襲血管內(nèi)皮細胞的能力很大程度上減弱[4-5]，這就表明，隱球菌穿過血腦屏障中，莢膜起到至關(guān)重要的作用。研究人員發(fā)現(xiàn)隱球菌B3501菌株 (野生株)在24 h后能通過體外血腦屏障模型，猜測隱球菌穿過血管內(nèi)皮細胞的快慢，可能和其莢膜的厚薄有關(guān)[5]。進一步的研究還表明，穿透血腦屏障后，隱球菌的莢膜結(jié)構(gòu)會發(fā)生相應(yīng)變化[6]。

尿素酶尿素酶 (Urease)也是隱球菌致病因素之一[7]。有實驗表明，被敲除尿素酶基因的隱球菌缺陷株和野生株相比較，其在動物實驗中的死亡率明顯降低。有研究進一步說明隱球菌可以利用尿素酶穿透血腦屏障[8]。

磷脂酶隱球菌能夠表達磷脂酶B1,其具有溶血磷脂酶、溶血磷脂轉(zhuǎn)酰基酶、磷脂酶B三種酶的活性[9]。隱球菌能夠借助單核-巨噬細胞系統(tǒng)滲透通過血腦屏障，造成腦部感染，而隱球菌分泌的磷脂酶是抵御單核-巨噬細胞的殺傷的重要因素[10]。

1.2隱球菌中樞感染的途徑

“木馬”機制隱球菌侵入人體后，巨噬細胞和NKL細胞主動識別外來微生物病原體后進行吞噬，但是隱球菌能夠在巨噬細胞中存活和復(fù)制[11-12]。Charlier等[13]的研究表明，人感染隱球菌后，取出骨髓產(chǎn)生的單核巨噬細胞，和同劑量的游離菌分別注入到健康的小鼠中，單核巨噬細胞組引起小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的比率高于游離菌組。還有學者Santangelo等[14]研究表明，靜脈注射磷脂酶缺陷的菌株不會引起小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染，但讓單核巨噬細胞吞噬該菌株后，再次靜脈注射，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)了小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染；這些研究結(jié)果表明，隱球菌利用單核巨噬細胞作為一種載體和偽裝的工具，讓免疫系統(tǒng)無法監(jiān)測，從而穿過血腦屏障引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染。

跨內(nèi)皮細胞途徑Chang等[4]利用透射電子顯微鏡觀察到了隱球菌能夠被吞噬進入內(nèi)皮細胞，且胞內(nèi)被吞噬的隱球菌由膜性小泡狀結(jié)構(gòu)包裹，6 h后隱球菌穿出內(nèi)皮細胞，到達體外血腦屏障模型的基膜側(cè)。Shi等[15]則用活體顯微鏡，觀察到了在實驗動物體內(nèi)，隱球菌通過跨內(nèi)皮細胞方式穿過血腦屏障。隱球菌與血管內(nèi)皮細胞相互作用過程中，內(nèi)皮細胞表面可觀察到微絨毛樣突起[4]，這一內(nèi)皮細胞的肌動蛋白骨架結(jié)構(gòu)的改變，需要宿主細胞膜表面受體CD44分子及其配體透明質(zhì)酸的相互作用。而有研究表明，透明質(zhì)酸酶能夠抑制隱球菌與血管內(nèi)皮細胞的黏附能力[16]，并且不同菌株與內(nèi)皮細胞的黏附能力與其細胞壁透明質(zhì)酸含量呈相關(guān)關(guān)系。若用CD44分子特異性中和抗體，也能夠有效夠阻斷隱球菌同內(nèi)皮細胞的黏附[17]。在黏附過程中，脂筏結(jié)構(gòu)是多種分子相互作用的平臺，富集CD44受體分子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子以及骨架蛋白，發(fā)揮“腳手架”作用[17-19]。

細胞旁途徑細胞旁途徑是指病原微生物通過細胞連接間隙滲透通過血腦屏障，但是該過程中可伴隨或不伴隨細胞間的緊密連接的破壞[20]。有研究表明，新生隱球菌表面的受體可以結(jié)合宿主來源的纖溶酶原[21]，纖溶酶原在纖溶酶原激活物，如組織型纖溶酶原激活物 (tPA)和尿激酶 (UPA)等作用下被激活轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘睦w溶酶，后者進一步降解細胞外的纖維蛋白等其他蛋白，同時激活基質(zhì)金屬蛋白酶。而基質(zhì)金屬蛋白酶能夠降解血管內(nèi)皮細胞間的緊密連接蛋白和細胞外基質(zhì)，促進病原菌穿過血管結(jié)構(gòu)擴散到周圍組織[22]。Stie等[23]研究發(fā)現(xiàn)，隱球菌表面結(jié)合纖溶酶后再和血管內(nèi)皮細胞共同孵育，缺乏tPA的情況下，纖溶酶原被激活成為有活性的纖溶酶，細胞外基質(zhì)被侵蝕的程度加深。這個研究表明，血管內(nèi)皮細胞自身含有激活纖溶酶原的能力。Stie等[24]進一步研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞與隱球菌共孵育后，尿激酶基因的表達升高，干擾尿激酶的表達或使用尿激酶特異性抑制劑均阻斷了纖溶酶原的活化，從而降低隱球菌的穿透血腦屏障的能力。以上研究都充分說明，隱球菌可以利用纖溶酶系統(tǒng)增強其侵襲宿主血腦屏障的能力。

2　基質(zhì)金屬蛋白酶的作用研究

基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases MMPs)是一類由金屬離子Zn2+、Ca2+等作為輔酶參與構(gòu)成的復(fù)合酶。其在pH=7時，活性最好。金屬蛋白酶主要以從細胞內(nèi)外分泌到內(nèi)環(huán)境的方式參與細胞外基質(zhì)的代謝調(diào)節(jié)，從而精確控制細胞外基質(zhì) (ECM)的降解以及組織重塑的過程。目前已經(jīng)明確的人類MMPs有26種之多。根據(jù)作用底物不同，可以將MMPs大致分為以下5大類：分別為明膠類、膠原酶類、基質(zhì)降解素類、基質(zhì)溶解素類、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶類?；|(zhì)金屬蛋白酶類具有類似的功能結(jié)構(gòu)，其分為5個功能不同的結(jié)構(gòu)域組成:疏水信號肽序列、前肽片段區(qū)、催化活性區(qū)、富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)和羧基末端區(qū)。MMPs各蛋白酶類之間的功能不僅是相互有關(guān)的，而且也保持著各自的特異性。如某種金屬蛋白酶可同時降解多種細胞外基質(zhì)成分，而特定的細胞外基質(zhì)成分又可被多種金屬蛋白酶同時降解。除此之外，不同的酶，其底物選擇有特異性，降解效率也是不同的。

MMPs參與人體許多正常的生理功能,如神經(jīng)的發(fā)育、血管形成、基質(zhì)的降解以及細胞凋亡等。在正常的情況下，基質(zhì)金屬蛋白酶被激活的量非常低，并且有受到內(nèi)源性的組織抑制劑 (TIMPs)的調(diào)節(jié)。MMPs同時也參與了許多病理過程，如腦出血、腫瘤侵襲、動脈粥樣硬化等?；|(zhì)金屬蛋白酶MMPs明膠酶類，主要為分子量92kD的MMP-9和72kD的MMP-2的這兩種蛋白酶。MMP-9又稱明膠酶-B，是Zn2+依賴性蛋白。Cuzner等[25]研究表明MMP-9主要由血管內(nèi)皮細胞合成，Rosenberg等[26]進一步研究表明，MMP-9蛋白主要定位于神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細胞及膠質(zhì)細胞等，而MMP-9以無活性酶原被分泌到細胞外，會被活化的纖溶酶和MMP-3等活化。正常情況下，MMP-9酶原體內(nèi)被激活后會迅速被降解，以防止其過度的活化而引起內(nèi)壞境的破壞，因而組織中只有極低水平的活化MMP-9[27]。人正常腦組織中只有pro-MMP-9，而無活性的MMP-9，但在病理情況下，內(nèi)源性途徑的星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞以及外源性途徑的內(nèi)皮細胞、滲出的中性粒細胞會分別大量分泌MMP-9。其被激活后，血腦屏障的完整結(jié)構(gòu)即被破壞。

隱球菌在利用纖溶酶系統(tǒng)中，隱球菌可以通過促進內(nèi)皮細胞S100A10基因和UPA基因的表達增加，使纖溶酶原活化為纖溶酶，降解細胞外基質(zhì)的同時，激活基質(zhì)金屬蛋白酶類 (MMPs)，包括MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13等等?；|(zhì)金屬蛋白酶可以分解細胞外基質(zhì)、細胞表面成分，可以降解膠原、層連蛋白、軟骨素等等[28-29]。在隱球菌致病條件下，宿主腦微血管內(nèi)皮細胞內(nèi)的MMP-9基因表達增加，且纖溶酶使無酶原活性的pro-mmp9蛋白大量轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腗MP-9,通過外分泌作用于血管內(nèi)皮下的細胞外基質(zhì)成分，使其降解，破壞血腦屏障完整性[26]。在通過纖溶酶和MMP-9共同降解細胞外基質(zhì)的雙重作用下，處于隱球菌致病因素下的血腦屏障失去最后的屏障作用，隱球菌則可以更容易穿過最后的屏障，進入人體大腦，引發(fā)隱球菌腦膜腦炎。

3　展　　望

近年來，人們發(fā)現(xiàn)免疫力正常的人群也可以感染隱球菌，而隱球菌腦膜炎作為隱球菌感染最主要的致死原因，其發(fā)病機制是研究的重點。除了已經(jīng)發(fā)現(xiàn)隱球菌侵襲中樞的致病因子的作用以及隱球菌突破血腦屏障的3條公認途徑之外，隱球菌還可以利用金屬蛋白酶的激活，使其侵犯血腦屏障。以上的這些研究成果都為隱球菌性腦膜腦炎的防治提供了新的方向。未來有必要進一步進行深入研究，獲取有效治愈隱球菌腦膜腦炎的新手段。

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[本文編輯]施慧

2016-05-13

國家自然科學基金 (31470252,81271800,31270181)

邱天文，男 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:872280290@qq.com

溫海,E-mail:wenhaipfk@126.com;朱紅梅，E-mail:hmzhu_cn@163.com

R 519.4

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1673-3827(2016)11-0190-03