孟 斐

（沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧 沈陽 110024）

CDK8缺失和/或SHP-2過表達后對SiHa 細胞增殖能力的影響

孟 斐

（沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧 沈陽 110024）

目的研究CDK8缺失和/或SHP-2過表達后對SiHa 細胞增殖能力的影響。方法 選取SiHa 細胞，利用RNA干擾技術(shù)，敲除CDK8，干擾CDK8蛋白表達；利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)高表達SHP-2蛋白。采用免疫印跡技術(shù)檢測CDK8和SHP-2蛋白表達，同時觀察并檢測SiHa 細胞的增殖能力的情況。結(jié)果 實驗結(jié)果表明，CDK8被干擾后，抑制了SiHa細胞的增殖能力； SHP-2過表達后，SiHa細胞的增殖能力無變化。結(jié)論 在宮頸癌細胞中，CDK8的缺失和/或SHP-2過表達影響SiHa 細胞的增殖能力，進一步驗證在宮頸癌細胞中CDK8和/或SHP-2與SiHa 細胞存在相關(guān)性。

CDK8；SHP-2；SiHa 細胞；增殖能力

世界范圍內(nèi)發(fā)病率在女性惡性腫瘤中排第二位的是宮頸癌[1]。當前，宮頸癌是婦科腫瘤中少量已找到明確病因的腫瘤之一，其發(fā)病主要是由于人乳頭瘤病毒（HPV）感染后引發(fā)機體內(nèi)源性反應，如激活有關(guān)癌基因、抑癌基因活性受到抑制和整個基因組機體免疫調(diào)節(jié)機制紊亂等一系列病理性改變，進而引發(fā)細胞增殖與凋亡的反常，致使正常組織發(fā)生癌變[2]。由本課題組以前的研究可知SHP-2在宮頸組織是HPV感染的免疫應答反應中的負性調(diào)節(jié)因子；CDK8是一個已知的致癌基因，且在宮頸癌中高表達；SHP-2在宮頸病變發(fā)生發(fā)展中的免疫調(diào)節(jié)機制，是誘導產(chǎn)生的TGF-β通過CDK8的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的。本文主要探討在宮頸癌細胞中，CDK8的缺失和/或SHP-2的高表達是否影響SiHa細胞的增殖能力，進一步驗證在宮頸癌細胞中CDK8和/或SHP-2與SiHa 細胞的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

SiHa細胞，CCK8（DojinDo，日本），0.25%Trypsin-EDTA(1X)（Gibco，美國），F(xiàn)etal Bovine Serum（Gibco，美國），96孔板（Corning，美國），酶標儀（Molecular Device，美國），倒置顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒感染靶細胞

第1d，以合適的比例接種靶細胞于T25的培養(yǎng)瓶中（兩組，對照組和處理組）。第2d，感染前，病毒原液從-80℃冰箱取出后冰浴融化，用含5μg/ml Polybrene的新鮮培養(yǎng)基按合適的MOI值稀釋病毒原液，吸除對照組和處理組原有的培養(yǎng)基，含有慢病毒陰性對照稀釋液加到對照組細胞中，含有CDK8敲低和SHP2過表達的慢病毒稀釋液加到SiHa細胞中 (換液時間可根據(jù)細胞狀態(tài)可適當延長)。第3d，感染效率檢測，實時定量PCR驗證CDK8的敲低效果；WB驗證SHP2的過表達效果。

1.2.2 細胞準備

小心吸去培養(yǎng)液，用1xPBS清洗，棄掉1×PBS后，加入適量胰酶；在顯微鏡下觀察細胞，若胞質(zhì)回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。棄去胰酶，加入適量預熱的新鮮培養(yǎng)液，將細胞吹打分散均勻，將細胞懸液吸入15mL離心管中，室溫，800rpm，離心5min ，棄去培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液，將細胞吹打均勻，血球計數(shù)板計數(shù)。

1.2.3 常規(guī)培養(yǎng)

以3000個（100μL）/孔的密度鋪于96孔板中，37℃，5%CO2，常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.4 MTT實驗

分別于24h，48h，72h，96h，120h后，在相應的孔（100μL培養(yǎng)液）中加入10μLCCK8（3復孔），37℃孵育2h后，450nm 測定吸光度（OD450）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

實驗結(jié)果表明，CDK8被干擾后，抑制了SiHa細胞的增殖能力； SHP-2過表達后，SiHa細胞的增殖能力無變化，見圖1，圖2。

圖1 實驗結(jié)果表明，CDK8被干擾后，抑制了SiHa細胞的增殖能力

圖2 SHP-2過表達后，SiHa細胞的增殖能力無變化

3 討 論

惡性腫瘤的發(fā)生過程是極其復雜的，它可以通過很多種不同的途徑發(fā)生，惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個漫長的過程，要經(jīng)過許多不同的階段，在惡性腫瘤發(fā)展的過程中細胞可能會過度增殖，而凋亡卻可能受到抑制，這種機體的平衡失控可能是腫瘤發(fā)展的因素之一[3]，因此抑制腫瘤細胞增殖和誘導其凋亡是治療腫瘤的方向之一。

CDKs在細胞增殖和分化中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4-5]，當CDK8調(diào)控作用發(fā)生異常時，將導致細胞增殖、分化或凋亡的異常，從而導致發(fā)育異?；蚣膊〉陌l(fā)生[6-7]。人類某些癌癥與CDK8的功能失調(diào)與過度表達存在相關(guān)性[8]。近來發(fā)現(xiàn)，SHP-2參與了許多人類疾病的發(fā)病，而轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立證實SHP-2在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用?？茖W研究已證實，激活免疫反應的，是機體內(nèi)一類天然免疫識別受體“家族”，學名叫做Toll樣受體。它們能識別病毒，“通知”

免疫細胞，并“誘導”后者產(chǎn)生抗病毒的炎癥細胞因子和I型干擾素等。安華章等發(fā)現(xiàn)：SHP-2是免疫系統(tǒng)的“剎車蛋白”，它在免疫反應中起負向調(diào)控作用。每每免疫反應被激活，就會有一類名為SHP的蛋白磷酸酶伴隨出現(xiàn)。進一步研究顯示，SHP-2分子正是免疫系統(tǒng)中的“剎車”，當病原體統(tǒng)統(tǒng)被消滅后，SHP-2會“喊?！?，讓免疫反應適可而止。一旦身體狀況出現(xiàn)異常，“剎車”便“失靈”了，給了疾病可乘之機[9]。

本組資料中選取SiHa 細胞，利用RNA干擾技術(shù)，敲除CDK8，干擾CDK8蛋白表達；利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)高表達SHP-2蛋白。采用免疫印跡技術(shù)檢測CDK8和SHP-2蛋白表達，同時觀察并檢測SiHa細胞的增殖能力情況，結(jié)果顯示CDK8被干擾后，抑制了SiHa細胞的增殖能力；SHP-2過表達后，SiHa細胞的增殖能力無變化，說明了在宮頸癌細胞中，CDK8的缺失和/或SHP-2的表達影響SiHa 細胞的增殖能力，進一步驗證在宮頸癌細胞中CDK8和/或SHP-2與SiHa 細胞存在相關(guān)性。

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ISSN.2095-8803.2016.10.017.02