王方園陳志婷,3鄧雄威吳雁張悅楊風(fēng)波楊仕明吳南

1解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉研究所聾病教育部重點實驗室(北京100853)

2國家納米科學(xué)中心（北京100190）

3首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100029）

·基礎(chǔ)研究·

HA-bPEI納米顆粒攜帶Atoh1質(zhì)粒豚鼠耳蝸轉(zhuǎn)染觀察

王方園1陳志婷1,3鄧雄威2吳雁2張悅1楊風(fēng)波1楊仕明1吳南1

1解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉研究所聾病教育部重點實驗室(北京100853)

2國家納米科學(xué)中心（北京100190）

3首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100029）

目的利用透明質(zhì)酸（HA）修飾分支型聚乙烯亞胺（bPEI）納米顆粒制備新型非病毒基因載體，包載Atoh1-EGFP質(zhì)粒，檢測其在活體豚鼠內(nèi)耳的轉(zhuǎn)染效率。方法質(zhì)粒提取后按照COOH/N/P=4:10:1合成納米載體基因復(fù)合物并進行表征。利用圓窗膜滲透的方法，導(dǎo)入實驗動物耳蝸。術(shù)后7天，通過激光共聚焦掃描觀察基底膜鋪片和切片了解轉(zhuǎn)染情況，并利用Western Blot和RT-PCR技術(shù)分別從蛋白和核酸水平驗證轉(zhuǎn)染結(jié)果。結(jié)果按照本研究實驗方法可成功合成表面帶有負電荷的納米級別的基因載體復(fù)合物顆粒，導(dǎo)入實驗動物耳蝸后7天取材，基底膜鋪片的共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示：基底膜內(nèi)外毛細胞可檢測到綠色熒光蛋白顯色，基底膜底轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)染效率達81.7±4.71%，中轉(zhuǎn)可達33.8±9.02%。結(jié)合冰凍切片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達的綠色熒光蛋白主要位于耳蝸底轉(zhuǎn)和部分中轉(zhuǎn)，頂轉(zhuǎn)及內(nèi)外毛細胞以外區(qū)域未見綠色熒光蛋白表達。基底膜細胞未見明顯變形損傷。Western Blot和RT-PCR結(jié)果也驗證了Atoh1基因在基底膜上的成功轉(zhuǎn)染。結(jié)論HA修飾bPEI納米顆粒制備基因載體可成功實現(xiàn)耳蝸的基因轉(zhuǎn)染，且未見對基底膜細胞產(chǎn)生明顯的毒性。合成簡單、成本較低，是理想的內(nèi)耳基因轉(zhuǎn)染載體。

透明質(zhì)酸；分支型聚乙烯亞胺；Atoh1基因；內(nèi)耳基因轉(zhuǎn)染

Funds by The National High-tech R$D Program of China for young Scientists(2014AA020510),National Basic Research Program of China (973 Program)(#2012CB967900),NationalMinistry ofscience and technology new drug creation majorproject (2014ZX09J14101-06C);National Natural Science Foundation of China(NSFC 81470700)；Innovation and drive power engineering project of China association for science and technology(2016CXQD01)

Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest

選擇理想的基因載體一直是內(nèi)耳基因治療研究的難題[1]。理想的基因載體應(yīng)該是既能靶向地進入目的細胞，又能在目的細胞內(nèi)有效地釋放目的基因，且不會對目的細胞產(chǎn)生與治療無關(guān)的毒副作用。目前比較常見的基因載體是重組病毒載體。病毒類載體有很高的轉(zhuǎn)染效率及較強的攜帶能力，可攜帶目的基因有效地進入靶細胞，但病毒類載體也有很明顯的缺點，如有明顯的細胞毒性及免疫原性，且易引起靶細胞基因重組，缺乏細胞類型選擇性[2,3]，大大限制了其進一步應(yīng)用。因此，非病毒載體，包括陽離子脂質(zhì)、陽離子聚合物等，由于其低成本、無免疫原性及修飾后的低毒性近年來逐漸成為耳科學(xué)及其他以再生為目的的基因治療研究所需載體的新選擇[4,5]。

既往針對耳蝸內(nèi)基因轉(zhuǎn)染的研究發(fā)現(xiàn)，僅有少量的非病毒載體可成功介導(dǎo)向耳蝸內(nèi)的目的基因轉(zhuǎn)染，但大都存在轉(zhuǎn)染效率低下的問題[6-8]。本研究利用可生物降級的透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid,HA）修飾分支型聚乙烯亞胺（branched Polyetherimide,bPEI）納米復(fù)合物顆粒，包載Atoh1-EGFP基因質(zhì)粒，通過圓窗膜途徑轉(zhuǎn)染正常豚鼠耳蝸，觀察其轉(zhuǎn)染效率及可行性。

1 研究方法

1.1 試驗對象及分組

采用北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供的6～8周SPFⅡ級健康白色紅目豚鼠6只，雌雄不限，體重200-250g，毛色健康，健康營養(yǎng)狀況良好，耳鏡下見雙耳道清潔，鼓膜完整，粗測聽力耳廓反應(yīng)靈敏，由解放軍醫(yī)學(xué)院動物實驗中心按照標(biāo)準(zhǔn)程序統(tǒng)一分籠飼養(yǎng)。選擇右耳為術(shù)耳，對側(cè)耳為對照組。實驗開始前均進行ABR聽力檢測，聽閾位于20-30 dB SPL。

1.2 納米載體基因復(fù)合物制備及表征測定

Atoh1-EGFP質(zhì)粒菌種由陳志婷博士（北京安貞醫(yī)院）饋贈。搖菌后按照Invitrogen去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒說明書步驟提取質(zhì)粒。測定質(zhì)粒濃度，按照N/P=10:1將Atoh1-EGFP質(zhì)粒及bPEI納米顆粒等體積混溶于20 mM HEPES緩沖液中（PH=7.4），室溫下渦旋反應(yīng)20分鐘，獲得bPEI/Atoh1-EGFP復(fù)合物。再按照COOH/N/P=4:10:1向bPEI/Atoh1-EGFP復(fù)合物中加入HA，HA通過靜電力與bPEI/DNA復(fù)合物結(jié)合，最終獲得HA/bPEI/Atoh1-EGFP復(fù)合物。

將HA/bPEI/Atoh1-EGFP復(fù)合物納米粒加入HEPES緩沖液進行稀釋，至最終DNA濃度為3mg/ mL。在生理條件PH=7.4環(huán)境下利用Zetasizer粒徑測定儀測試復(fù)合物粒徑及Zeta電位測定。測試反復(fù)進行三次，取平均值。

取少量復(fù)合物混合液，滴在電鏡觀測所需的干凈銅網(wǎng)上，過夜晾干。3%磷鎢酸負染色，利用透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)觀察復(fù)合物顆粒形態(tài)。

1.3 手術(shù)導(dǎo)入

實驗對象予以水合氯醛（10%，0.45ml/100g）腹腔注射麻醉。刮除耳周毛發(fā)。實驗動物呈左側(cè)臥位，右側(cè)耳向上，碘伏棉球消毒右側(cè)耳周及耳廓。眼科剪以耳垂下約5mm處為切口中心橫行剪開皮膚及皮下組織，鈍性分離顳骨表面的肌肉組織，暴露聽泡，于聽泡表面打一1×1mm2小孔，顯微鏡下經(jīng)小孔定位圓窗龕及其內(nèi)的圓窗膜。將浸滿納米復(fù)合物的明膠海綿放置貼敷在圓窗龕，分層縫合組織。

1.4 基底膜冰凍切片、鋪片及激光共聚焦顯微鏡觀察

導(dǎo)入術(shù)后7天，實驗動物麻醉（方法同前）后，迅速斷頭，快速分離取出聽泡內(nèi)耳蝸，置于4%多聚甲醛中4℃固定過夜。制備冰凍耳蝸切片前需10% EDTA脫鈣1周，隔天換液一次，30%蔗糖溶液脫水48h，OCT包埋，利用冰凍切片機獲得過蝸軸的耳蝸切片，層厚6μm。

制備基底膜鋪片需要在倒置顯微鏡下，輕柔去除耳蝸表面蝸殼組織、血管紋、螺旋韌帶及懸浮的前庭膜、蓋膜。取出游離的基底膜。

基底膜切片及鋪片DAPI染色前0.01M PBS漂洗2次，每次3分鐘。加入細胞核染料DAPI，室溫孵育10min，再用0.01M PBS洗2次，每次5min，將游離基底膜平鋪于載玻片后甘油封片。取制備好的玻片，利用Zeiss 780共聚焦顯微鏡(confocal microscopy)觀察EGFP表達綠色熒光蛋白的情況以了解Atoh1基因的轉(zhuǎn)染情況。

1.5 Western blot檢測

導(dǎo)入術(shù)后7天，按基底膜取材方法快速取出新鮮基底膜。放置于冷凍管中冷凍于液氮中。并在液氮環(huán)境下將耳蝸組織研碎，加入預(yù)先配制的蛋白裂解緩沖液中，輕輕晃動混勻。冰浴40min后收集蛋白提取液，4℃離心機中離心20min，(12000轉(zhuǎn)/min)。吸取上清液，-80℃冷凍保存待用。

配置SDS-PAGE膠，吸取15ul樣本，分別加入5ul 4×蛋白質(zhì)凝膠電泳緩沖液混勻，98℃變性5min，即刻插入冰中，渦旋數(shù)秒，短暫離心。設(shè)置電泳儀，調(diào)整電壓為80V，保持穩(wěn)壓狀態(tài)，共運行約40min，使樣品通過濃縮膠。觀察染料進入膠面情況，當(dāng)染料開始進入分離膠，再次調(diào)整電壓，至120V，繼續(xù)電泳約60min，直至染料分離，結(jié)束電泳。凝膠轉(zhuǎn)膜及封閉，將Atoh1抗體按照說明書推薦濃度1：50封閉液稀釋，進行抗體孵育及曝光，收集結(jié)果。

1.6 RT-PCR檢測

實驗動物處死以及基底膜取材方法同上。按照Invitrogen組織提取總RNA試劑盒的說明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴增(94℃預(yù)變性5min-94℃變性30s-57℃退火30s，30個循環(huán)-72℃延伸 30s-72℃延伸 5min)。引物：F:5’-GGTA?AAAGAGTTGGGGGACC-3’; R: 5’ -TGGA?CAGCTTCTTGTCGTTG-3’.產(chǎn)物電泳測定結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

每個基底膜標(biāo)本的底、中、頂轉(zhuǎn)上分別選取3個視野計算轉(zhuǎn)染效率，視野下每100個細胞中計數(shù)成功轉(zhuǎn)染細胞個數(shù)，計算均值及標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。

2 結(jié)果

2.1 納米復(fù)合物表征結(jié)果

本研究利用HA進行修飾后，納米基因載體復(fù)合物粒徑約為220±9 nm，為納米級別復(fù)合物。其Zeta電位測量結(jié)果顯示為-25.2±1.9 mV，表面為負電荷。利用透射電鏡對納米復(fù)合物的形態(tài)進行觀察發(fā)現(xiàn)，納米復(fù)合物顆粒呈球形顆粒（圖1），其粒徑大小在100nm-600nm之間，這粒徑儀測得的粒徑大小一致。

圖1 復(fù)合物透射電鏡下形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphology of Nanoparticle

2.2 納米基因載體復(fù)合物介導(dǎo)Atoh1基因轉(zhuǎn)染耳蝸情況

基底膜外毛細胞內(nèi)EGFP綠色熒光蛋白表達可自底轉(zhuǎn)一直到中頂轉(zhuǎn)，除頂轉(zhuǎn)外，余區(qū)域基底膜外毛細胞區(qū)域均可見綠色熒光蛋白表達，且在部分區(qū)域，外毛細胞的靜纖毛也出現(xiàn)了綠色熒光蛋白的表達，通過計數(shù)統(tǒng)計可見目的基因在基底膜底轉(zhuǎn)外毛細胞的轉(zhuǎn)染效率達81.7±4.71%，中轉(zhuǎn)可達33.8±9.02%。但內(nèi)毛細胞內(nèi)的綠色熒光蛋白仍只表達在中轉(zhuǎn)以下，轉(zhuǎn)染效率僅為8.9±1.85%（圖2）?；啄じ鲄^(qū)域細胞形態(tài)尚佳，核完整，未見明顯損傷或死亡。

圖2 外毛細胞內(nèi)EGFP綠色熒光蛋白表達可自底轉(zhuǎn)一直到中頂轉(zhuǎn)，中轉(zhuǎn)一下的內(nèi)毛細胞區(qū)域也可見EGFP的表達（A-C），除頂轉(zhuǎn)外（D），余區(qū)域基底膜均可見綠色熒光蛋白表達。在部分區(qū)域（E），外毛細胞的靜纖毛也出現(xiàn)了綠色熒光蛋白的表達。冰凍切片（F）箭頭為EGFP表達區(qū)域Fig.2 The expression of EGFP in OHCs can be detected from the basal turn to the middle-top turn of Basilar membrane，some EGFP were also observed in IHCs(A-C),except for the apical turn(D).In some regions(E),the expression of EGFP was also observed in the stereocilia of OHCs.The arrow in F was the EGFP.

2.3 Western blot及反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果

實驗動物分別取4只耳蝸提取總蛋白和總RNA，進行Western blot及反轉(zhuǎn)錄PCR分析，分別從蛋白及核酸水平驗證了Atoh1基因的成功表達（圖3）。

圖3 Western blot（A）及反轉(zhuǎn)錄PCR（B）結(jié)果：1為導(dǎo)入組，2為陰性對照。Fig.3 Western blot(A)and RT-PCR(B)results:Nanoparticles treatment(lane1);Negative control(lane2)

3 討論

耳蝸是人體感知聽覺的器官，深埋于顱骨，是一個相對封閉的結(jié)構(gòu)，且耳蝸存在血迷路屏障，類似于血腦屏障，可有效減少外部器官有害物質(zhì)的侵襲，但也降低了全身用藥的有效性。耳蝸內(nèi)感知聽覺的關(guān)鍵細胞--毛細胞深藏于耳蝸內(nèi)部，周圍是特殊的內(nèi)/外淋巴液環(huán)境，這就導(dǎo)致即使是局部的給藥也很難達到毛細胞。因此，選擇合適的基因轉(zhuǎn)染途徑是成功實現(xiàn)耳蝸轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵之一。

關(guān)于利用非病毒載體轉(zhuǎn)染耳蝸的研究發(fā)現(xiàn)，已有研究者利用陽離子脂質(zhì)體完成了目的基因向耳蝸的轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染后14天可以發(fā)現(xiàn)目的基因表達在感覺神經(jīng)上皮細胞及其周圍組織[9]。但脂質(zhì)體可能影響細胞的生理活性，如可能抑制線粒體內(nèi)膜或蛋白激酶C及ATP酶的活性，導(dǎo)致細胞毒性，因此限制了其被進一步的研究[10-12]。此外，還有多種人工合成的聚合物也可以作為基因載體實現(xiàn)內(nèi)耳基因遞送，如聚乳酸/乙醇酸、PLGA及PAMAM等，但都存在轉(zhuǎn)染效率不高的問題[13-15]。本研究小組前期，曾成功利用陽離子聚合物PAMAM衍生物將目的基因轉(zhuǎn)染入內(nèi)耳，但PAMAM衍生物合成過程復(fù)雜，制備過程可控性較差，合成產(chǎn)物穩(wěn)定性不佳，因此未能進一步應(yīng)用研究[16]。

在PEI作為納米載體向內(nèi)耳進行基因轉(zhuǎn)染的研究中，曾有利用lPEI作為載體成功將目的基因轉(zhuǎn)染入內(nèi)耳的研究[17]，但結(jié)合其他專業(yè)的研究結(jié)果顯示，與bPEI相比，lPEI的毒性較低但轉(zhuǎn)染效率也不高[18-20]。此外，粒徑大小也是納米載體的重要物理參數(shù)，粒徑大小與其生物膜的通透性密切相關(guān)。粒徑大小與分子量有一定關(guān)系，但并非分子量越小、粒徑越小越好。既往文獻表明，不同分子量的PEI轉(zhuǎn)染效率也有很大不同，分子量越低，其粒徑小，透過細胞能力強，但較低的分子量攜帶DNA的能力也低，因此轉(zhuǎn)染效率低。其中分子量為25 kDa的分支型PEI轉(zhuǎn)染效率最高。分支型PEI內(nèi)存在豐富的質(zhì)子緩沖能力及質(zhì)子化區(qū)域，具備很強的結(jié)合DNA及壓縮DNA能力。因此為了在提高轉(zhuǎn)染效率的前提下，降低毒性，我們選擇了25kDa的bPEI作為制備基因載體的原料。本研究合成的復(fù)合物粒徑可達220±9 nm，達納米級別。HA修飾后的PEI/DNA復(fù)合體Ze?ta電位測量結(jié)果顯示為-25.2±1.9 mV，因HA攜帶負電荷，說明HA可通過靜電結(jié)合力結(jié)合修飾PEI/DNA復(fù)合物，可覆蓋在PEI/DNA復(fù)合物表面，中和PEI表面的正電荷，首先可以盡可能避免其與細胞膜上帶負電荷的蛋白非特異性結(jié)合，在細胞膜表面形成大量的納米孔，導(dǎo)致細胞毒性[21-23]。

此外，既往關(guān)于利用PEI作為基因載體的研究發(fā)現(xiàn)，利用PEI-PEG作為基因載體可成功將X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)基因轉(zhuǎn)染如哺乳動物耳蝸內(nèi)螺旋神經(jīng)節(jié)細胞、血管紋、Corti器等結(jié)構(gòu)，且能實現(xiàn)聽力的保護作用[6]。但PEG為生物不可降解物質(zhì)，因增加了載體分解產(chǎn)物在耳蝸內(nèi)聚積，導(dǎo)致毒性。因此，選擇可被生物降解的修飾配體也是耳蝸轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵之一。2012年Shibata SB等利用可生物降解的材料----透明質(zhì)酸修飾腺相關(guān)病毒載體攜帶綠色熒光蛋白基因進行內(nèi)耳轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)HA修飾可有效提高病毒載體攜帶的EGFP基因的轉(zhuǎn)染效率[7]。本研究利用HA修飾bPEI制備納米基因載體，即可實現(xiàn)耳蝸毛細胞的高效轉(zhuǎn)染，也能盡可能降低轉(zhuǎn)染過程中的陽離子聚合物的細胞毒性及轉(zhuǎn)染后載體材料分子沉積導(dǎo)致的組織細胞毒性。為耳蝸基因轉(zhuǎn)染提供了新的載體選擇。

1 Pack DW,Hoffman AS,Pun S,et al.Design and development of polymers for gene delivery[J].Nat Rev Drug Discov,2005,4(7): 581-593.

2 史珣貝,吳南,郭維維,等.腺相關(guān)病毒在耳聾基因治療上的應(yīng)用[J].中華耳科學(xué)雜志,2016,14(1):37-42.

Shi XB,Wu N,Guo WW,et al.Application of adeno-associated vi?rus gene vectors in hereditary non-syndromic sensorineural hearing loss[J].Chinese Journal of Otology,2016,14(1):37-42.

3 Harris JD,Lemoine NR.Strategies for targeted gene therapy[J]. Trends Genet,1996,12(10):400-405.

4 Read ML,Singh S,Ahmed Z,et al.A versatile reducible polyca?tion-based system for efficient delivery of a broad range of nucleic acids[J].Nucleic Acids Res,2005,33(9):e86.

5 Yu H,Russ V,Wagner E.Influence of the molecular weight of biore?ducible oligoethylenimine conjugates on the polyplex transfectionproperties[J].AAPS J,2009,11(3):445-455.

6 Chen GG,Mao M,Qiu LZ,et al.Gene transfection mediated by poly?ethyleneimine-polyethylene glycol nanocarrier prevents cisplat?in-induced spiral ganglion cell damage[J].Neural Regen Res, 2015,10(3):425–431.

7 Shibata SB,Cortez SR,Wiler JA,et al.Hyaluronic acid enhances gene delivery into the cochlea[J].Hum.Gene Ther,2012,23:302–310.

8 陳志婷,楊仕明.納米載體在內(nèi)耳應(yīng)用的研究現(xiàn)狀[J].中華耳科學(xué)雜志,2014,12(1):151-154.

Chen ZT,Yang SM.Application of nano carriers in inner ear[J].Chi?nese Journal of Otology,2014,12(1):151-154.

9 Wareing M,Mhatre AN,Pettis R,et al.Cationic liposome mediated transgene expression in the guinea pig cochlea[J].Hear Res,1999, 128:61–69.

10 Felgner PL,Gadek TR,Holm M,et al.Lipofection:a highly effi?cient,lipid-mediated DNA-transfection procedure[J].Proc Natl Acad Sci USA,1987,84:7413–7417.

11 Bottega R,Epand RM.Inhibition of protein kinase C by cationic am?phiphiles[J].Biochemistry,1992,31:9025–9030.

12 Datiles MJ,Johnson EA,McCarty RE.Inhibition of the ATPase ac?tivity of the catalytic portion of ATP synthases by cationic amphiphi?les[J].Biochim Biophys Acta,2008,1777:362–368.

13 Jiang M,Zhang YQ,He GX and Sun H:Protective effect of NT-3 gene mediated by hydroxyapatite nanoparticle on the cochlea of guinea pigs injured by excitotoxicity[J].Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban,2007,32:563–567.

14 Tamura T,Kita T,Nakagawa T,et al:Drug delivery to the cochlea using PLGA nanoparticles[J].Laryngoscope,2005,115:2000–2005.

15 Wang H,Shi HB,Yin SK.Polyamidoamine dendrimers as gene de?livery carriers in the inner ear:How to improve transfection efficien?cy[J].Exp Ther Med,2011,2(5):777–781.

16 Wu N,Li M,Chen ZT,et al.In Vivo Delivery of Atoh1 Gene to Rat Cochlea Using a Dendrimer-Based Nanocarrier[J].J Biomed Nano?technol,2013,9(10):1736-1745.

17 Tan BT,Foong KH,Lee MM,et al.Polyethylenimine-mediated co?chlear gene transfer in guinea pigs[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg,2008,134(8):884-891.

18 Wiseman JW,Goddard CA,McLelland D,et al.A comparison of lin?ear and branched polyethylenimine(PEI)with DCChol/DOPE lipo?somes for gene delivery to epithelial cells in vitro and in vivo[J]. Gene Ther,2003,10(19):1654-1662.

19 Kwon YJ.Before and after endosomal escape:roles of stimuli-con?verting siRNA/polymer interactions in determining gene silencing ef?ficiency[J].Acc Chem Res,2012,45(7):1077-1088.

20 Kafil V,Omidi Y.Cytotoxic impacts of linear and branched polyeth?ylenimine nanostructures in a431 cells[J].Bioimpacts,2011,1(1): 23-30.

21 Yu H,Zou Y,Wang Y,et al.Overcoming endosomal barrier by am?photericin B-loaded dual pH-responsive PDMA-b-PDPA micelle?plexes for siRNA delivery[J].ACS Nano,2011,5(11):9246-9255.

22 Hong S,Leroueil PR,Janus EK,et al.Interaction of polycationic poly?mers with supported lipid bilayers and cells:nanoscale hole forma?tion and enhanced membrane permeability[J].Bioconjug Chem, 2006,17(3):728-734.

23 Hong S,Bielinska AU,Mecke A,et al.Interaction of poly(amido?amine)dendrimers with supported lipid bilayers and cells:hole for?mation and the relation to transport[J].Bioconjug Chem,2004,15(4): 774-782.

In vivo transduction of Atoh1 gene into cochlear cells mediated by HA-PEI nanoparticle vectors

WANG Fangyuan1,CHEN Zhiting1,3,DENG Xiongwei2,WU Yan2,ZHANG Yue1,YANG Fengbo1,YANG Shiming1,WU Nan1
1 Department of Otolaryngology Head and neck surgery,Key Laboratory of Deafness,Ministry of Education,Chinese PLA General Hospital,Beijing,100853
2 The National Center for Nanoscience and Technology,Beijing 100190
3 Department of Otolaryngology Head and neck surgery,Beijing An Zhen Hospital,Beijing 100029

ObjectiveTo test in vivo transfection efficiency of Atoh1-EGFP plasmids using hyaluronic acid modified branched polyethylenimine nanoparticles as a novel non-viral gene vector.MethodsPlasmids were extracted following kit instructions.The gene-vector nanoparticles were synthesized(COOH/N/P=4:10:1)and then characterized before being transduced into the inner ear through intact round window membrane.At 7 days after transduction operation,transfection efficiency was evaluated by examination of both basilar membrane surface preparation and frozen sections under a confocal microscope.Transfection results were finally verified by Western blot and RT-PCR at protein and nucleic acid levels respectively.ResultsWe successfully synthesized a non-viral gene vector which loaded Atoh1 gene well and had a negatively-charged surface to reduce possible cytotoxicity.At 7 days after transfection,confocal microscope observation of basilar membrane showed EGFP in OHCs and IHCs.OHC transfection efficiency was 81.7±4.71%in the basal turn and 33.8±9.02%in the middle turn.Frozen section results revealed expression of EGFP mainly in the basal turn and only part of the middle turn of the cochlea.No signs of EGFP transduction were seen in either the top of the cochlea or in cells other than hair cells.Furthermore,Basilar membrane cells showed no obvious damage after operation.Both Western Blot and RT-PCR results verified successful transfection of the Atoh1 gene on the basilar membrane.Conclusion The Atoh1 gene can be successfully transduced into the inner ear by the HA modified bPEI nanoparticles and there is no obvious cytotoxicity to cochlear cells.The new nanoparticles are easy to produce at a low cost,which makes it an ideal non-viral vector for inner ear gene transfection.

Hyaluronic acid；branched Polyetherimide；Atoh1 gene；inner ear gene delivery

R764.35

A

1672-2922（2016）06-803-5

2016-12-10審核人：翟所強）

10.3969/j.issn.1672-2922.2016.06.020

國家863青年科學(xué)家項目(2014AA020510)；國家973計劃重大科學(xué)研究計劃干細胞項目（2012CB967900)；國家科技部新藥創(chuàng)制重大專項（2014ZX09J14101-06C）；國家自然科學(xué)基金項目（NSFC 81470700）；中國科協(xié)創(chuàng)新驅(qū)動助力工程（2016CXQD01）

王方園，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，研究方向：毛細胞再生、聽覺植入

吳南,Email:maxpanda1979@126.com