王興華，王光耀，Te Kian Keong，TehSiew Hoon，OoiCiat Hui，葉儒佳，王智航

蛋白質組學研究的原理、技術與應用

王興華1，2，王光耀1△，Te Kian Keong2，TehSiew Hoon2，OoiCiat Hui2，葉儒佳1，王智航1

（1.南京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，江蘇南京210023；2.UniversitiTunku Abdul Rahman，Kajang，Malaysia）

蛋白質組包括細胞或生物所表達的全部蛋白質，蛋白質組學是在大規(guī)模水平上研究蛋白質的特征，包括蛋白質的表達水平、翻譯后的修飾、蛋白與蛋白之間的相互作用等。借以探析生命活動的生理基礎及其內在規(guī)律，了解疾病發(fā)生、發(fā)展與細胞代謝過程，在蛋白質水平上獲得整體而全面的認識，它是蛋白質（多肽）譜研究以及基因產物圖譜研究的進一步延伸。蛋白質組學的核心技術是雙向電泳、質譜及生物信息學，相關技術還涉及相對和絕對定量同位素標記、蛋白質芯片，多維色譜等。已被廣泛應用于生命科學研究的諸多領域，尤其是癌癥等危害人類較大的疾病防治，受到越來越多的關注。

蛋白質組學；雙向電泳；質譜；生物信息學；同位素標記；蛋白質芯片；多維色譜；癌癥

0　引言

蛋白質組是一種基因組所表達的全套蛋白質，包括一種細胞或一種生物所表達的全部蛋白質。蛋白質組的外文名（Proteome）源于蛋白質（protein）與基因組（genome）兩個實詞的重新組合，其本質是在大規(guī)模水平上研究蛋白質的特征，包括蛋白質的表達水平、翻譯后的修飾、蛋白與蛋白之間的相互作用等。借助這種研究，就可以探析生命活動的生理基礎及其內在規(guī)律，了解疾病發(fā)生、發(fā)展與細胞代謝過程，在蛋白質水平上獲得整體而全面的認識［1］。蛋白質組學的核心技術是雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）、質譜（mass spectrometry）及生物信息學（bioinformatics）等，已被應用于生命科學研究的諸多領域，受到越來越多的關注。

1　基本原理

研究正常生理個體間的蛋白質組，同時也研究異常病理個體間的蛋白質組，將二者進行對比、分析，找出相同點與差異點，就有可能發(fā)現某些疾病的特異性蛋白質分子，以提供疾病早期診斷的分子標志。將此作為分子靶點，設計新藥物，深入研究，以求攻克［2］。由此可見，蛋白質組學的研究，能為生命活動規(guī)律提供物質基礎，也能為闡明疾病發(fā)生、發(fā)展的機理提供根據，作為尋找解決問題的有效途徑，以利于消除這些疾病。

蛋白質組學探索，是生命科學進入后基因時代的研究新途徑，是未來科學揭示生命奧秘的先進方向，能與其它科學研究一樣，更好地為人類的健康事業(yè)服務，并有可能發(fā)揮更大的社會效益，甚或由之產生巨大的經濟利益。

蛋白質組不等同于基因組，二者之間有較大差別。蛋白質會伴隨組織、環(huán)境等狀態(tài)的差別而改變。在轉錄過程中，一個基因可以多種信使核糖核酸（mRNA）形式剪接，同一蛋白也可能以多種形式進行翻譯后的修飾。在蛋白質組中，蛋白質的數目，有時可以超過基因組的數目。蛋白質組學不是單純的方法學，不是一個封閉的知識體系，而是一個更大范圍、更大規(guī)模的研究領域。蛋白質組學集中于基因調節(jié)的動態(tài)描述，定量測定基因表達的蛋白質水平，觀察疾病對生命過程的影響，鑒定藥物對病理的作用靶點，解釋基因表達的調控機制［2］。蛋白質組學研究，是蛋白質（多肽）譜研究以及基因產物圖譜研究的進一步延伸。

人類基因組計劃，經過多個國家的科學工作者的團結協作和共同努力，人類基因的全序列測定，最終得以完成。其研究的標志性業(yè)績是：人類基因組工作草圖與初步分析結果。這些內容已經被人類基因組計劃組織和美國Celera 公司公布，先后刊載于世界頂級自然科學刊物《Nature》與《Science》上。研究成果是巨大的，其重要貢獻是為人類在基因活性與疾病的相關性方面，提供了客觀證明和微觀依據。現在的問題是，不少疾病的發(fā)生，并非全由基因的改變所引起，還有導致多種疾病發(fā)生與發(fā)展的其它病原和影響因素?；虮磉_的方式多種多樣，相當復雜。如果條件不同，或者時間不同，即使是完全相同的基因，也有可能起到異樣作用，會隨時發(fā)生變化，有的甚至可以發(fā)生突變、畸變，甚至癌變，差別非常大。關于這些方面的難題，僅僅依靠基因組學的研究，是不可能攻克的。因此，后基因組學的研究，就顯示出必要性。鑒于蛋白質在人體生理病理中產生的重要作用，科學工作者已經將探索目標轉移到蛋白質功能的研究上來。尤其是蛋白質組學的研究，更有希望解決以上難題，也正順應了這個發(fā)展趨向，并突顯出蛋白質組學研究在攻克人類眾多疾病中的重大意義。

蛋白質組學研究是一項更為復雜、更具有挑戰(zhàn)性的科學探索，需要國際間的協作與配合。專門研究人類蛋白質的組織（HUPO）已經在美國建立，并由此拉開了國際合作研究的序幕。世界各地的生命科學研究工作者，廣泛開展了各種生物體的蛋白質組學研究。為了避免重復，減少浪費，各個國家開展的蛋白質組學研究，既有協作，又有側重，以集中人力、物力、財力等方面的優(yōu)勢資源，尋求重點突破。例如：人類肝臟蛋白質組學的研究計劃就由中國牽頭，其它國家輔助，互相配合，協作攻關。余如人類血液蛋白質組學的研究計劃，則由美國科學界牽頭；人類腦蛋白質組學的研究計劃，即由德國科學界牽頭。在中國，政府非常重視這一工作，在蛋白質組學的研究工作方面，投入了大量的優(yōu)質資源，給予人力、物力、財力等方面的鼎力支持，已經將其列為目前到2020年的研究重點，并收入《國家中長期科學與技術發(fā)展綱要》。在國家現階段設立的四個重大科學研究計劃中，蛋白質組學計劃就是其中之一，成為當前國家科學研究的重點突破方向。

基因組包含的遺傳信息，經轉錄產生信使核糖核酸（mRNA），mRNA經過翻譯之后，產生相應的蛋白質。翻譯后修飾是蛋白質調節(jié)功能的重要方式。在特定生理條件或病理狀態(tài)下，某一細胞表達的各種蛋白質，構成其蛋白質組。在不同生理條件或病理過程中，各種細胞所表達的蛋白質的種類，有一定差別。研究蛋白質的結構、定位以及它們之間的相互作用，將為觀察和闡釋生命現象，揭示疾病發(fā)生、發(fā)展、變化的本質，提供直接的微觀的客觀的證據。

二維電泳與質譜技術的巧妙結合，形成蛋白質組學研究中的理念結合與技術佳配，具有相輔相成的促進作用和協同效果，為科學工作者研究蛋白質的表達規(guī)律提供了理想的可行的技術支持［3］。探索蛋白質與蛋白質之間的相互作用，將是這一研究領域的重要方面。

蛋白質組學系基因能表達全部蛋白質，其研究是針對不同時間和/或空間上發(fā)揮功能性的特定蛋白質群組，探索其作用機理、功能模式及其群組內的相互作用、調節(jié)與調控，為生理研究、病理分析、臨床診斷、新藥開發(fā)、藥品篩選、代謝途徑等，提供客觀依據，建立理論基礎［4］。蛋白質組學研究的重點目標和發(fā)展方向，主要是為了促進分子醫(yī)學的發(fā)展，如尋找藥物靶分子，消除致病基因，修復正常生理基因，以利于攻克疾病，促進機體恢復健康。

2　核心技術

2-DE是雙向凝膠電泳技術。蛋白質有2個重要的理化特性，一是等電點，二是分子量。根據樣品中的這2個蛋白質理化特性，可以將其分離。原理：一是向基于蛋白質PI不同用等電聚焦分離，二是按MW的不同用聚丙烯酰胺十二烷基硫酸鈉凝膠電泳分離。這樣，復雜蛋白混合物中的蛋白質，就會依據其理化特性，在二維平面上自行分離。差異凝膠電泳，是提取2個不同樣品中的蛋白質，分別標記以不同的熒光染料，再將標記后的2個樣品混合，進行雙向凝膠電泳。因發(fā)光波長不同，同一塊膠上2個樣品的蛋白質，可以自行分離，并能測出其含量。因其通量高，分辨率好，具有可重復性，可與質譜分析技術聯用，故成為當今最流行的蛋白質組學的研究手段，屬于最可靠的實驗方法。2-DE技術，可以廣泛應用于各種蛋白質組學的研究，成為研究結構蛋白質組與功能蛋白質組的重要方法［5］，最具有實際應用價值。在蛋白質組學研究的實驗技術中，屬于不可或缺的項目，占據著十分重要的地位。

質譜分析，是唯一可以確定分子質量的方法。在高分辨率質譜儀中，能夠準確測定質量，而且可以確定化合物的化學結構式，并進行結構分析。質譜法的靈敏度極高，鑒定的最小量可達10-10g，檢出限可達10-14g。質譜儀的種類多樣，如：有機質譜儀、無機質譜儀、同位素質譜儀等。其中有機質譜儀有氣-質、液-質、富變質譜儀，激光解吸飛行時間變質譜儀等。質譜分析是用高速電子，撞擊氣態(tài)分子或原子，將電離后的正離子加速，導入質量分析器。試樣在離子源內被氣化、電離。用電子轟擊法在10-5Pa高真空下，以50-100eV能量的電子流轟擊試樣，有機物常常被擊出一個電子。若加速電壓和磁場強度都一定時，不同m/z的離子，由于運動的曲線半徑不同，在質量分析器中彼此分開。在磁場中，按質荷比（m/z）大小，進行收集和記錄，得到質譜圖。根據質譜峰的位置，進行物質的定性，作結構分析。還可根據峰的強度，進行定量分析。其原理是受試樣品，從進樣器進入離子源，在離子源中產生正離子。正離子加速進入質量分析器，質量分析器將離子按質荷比大小不同進行分離。分離后的離子先后進入檢測器，檢測器得到離子信號，放大器將信號放大，并記錄在讀出裝置上。通過正確測定蛋白質分子的質量，進行蛋白質分子鑒定、修飾和相互作用的研究［6-7］?；|輔助激光解析電離飛行時間質譜，可檢測離子，并確定分子量，能反映被檢測樣本中蛋白質的全部情況，找到多個蛋白質標志物。

生物信息學技術，是分子生物學與信息技術的結合體，是利用數學、統計學、應用信息學、計算機科學等方法，研究生物學中的問題。生物信息學的研究材料和結果就是各種各樣的生物學數據，其研究工具是計算機。研究方法，包括對生物學數據的搜索、收集、篩選、處理，包括編輯、整理、管理和顯示，利用、計算和模擬等。目前主要的研究有：基因識別、基因重組、基因表達、序列比對、蛋白質結構預測、蛋白質反應預測，以及建立進化模型等。生物學技術生成大量的復雜數據，生物信息學利用數學工具，從大量數據中提取有用的生物學信息。生物信息學處理的問題：重新組裝在霰彈槍定序法測序過程中被打散的DNA序列，從蛋白質的氨基酸序列預測蛋白質結構，利用mRNA微陣列或質譜儀的數據檢驗基因調控的假說。生物信息學技術通過蛋白質微陣列技術或高通量質譜分析，對生物標本進行測量，獲得數據，其中包含有大量生物標本內蛋白質的信息。生物信息學被廣泛應用于這些數據的分析［8］。Michael Waterman是這方面的行家里手，他率先將數學和計算方法引入生物學研究，將數學、統計、計算機科學應用于各種分子生物學問題的研究中，開辟了多個重要的研究方向，在生物信息領域有不少創(chuàng)新性的貢獻。他受聘于清華大學，為清華大學的生物信息學學科發(fā)展作出了突出貢獻。2013年，他榮獲了外國專家在中國從事研究工作的國際友誼獎。

相對和絕對定量同位素標記，是一種體外同種同位素標記的相對與絕對定量技術，利用多種同位素試劑，標記蛋白多肽N末端或賴氨酸側鏈基團，經用高精度質譜儀串聯分析，可同時比較多達8種樣品之間的蛋白表達量，是定量蛋白質組學常用的高通量篩選技術。將蛋白質裂解為肽段，然后用試劑進行差異標記。由于試劑是等量的，用不同同位素，標記同一多肽后，在第一級質譜檢測，分子量完全相同。用串聯質譜方法，對在第一級質譜檢測到前體離子，進行碰撞誘導解離，產物離子，通過第二級質譜進行分析。通過數據庫查詢和比較，可以鑒定出相應的蛋白質前體［9］。技術特點是：定量精確、高效率樣品分離、高鑒定率、適用范圍廣、儀器性能優(yōu)良，可獲得更加準確的結果。

蛋白質芯片，是一種高通量的蛋白功能分析技術，用于蛋白質表達譜的分析，研究蛋白質與蛋白質的相互作用，篩選藥物作用的蛋白靶點。蛋白質芯片技術研究的原理，是對固相載體進行特殊的化學處理，再將已知的蛋白分子產物，如酶、抗原、抗體、受體、配體、細胞因子等，固定在其上面。根據這些生物分子的特性，捕獲能與其特異性結合的待測蛋白，經洗滌、純化，再進行確認和生化分析。為獲得重要生命信息，如未知蛋白組分、序列，體內表達水平，生物學功能，分子相互調控關系，藥物篩選，藥物靶位選擇等，提供有力的技術支持。蛋白芯片主要有三類：蛋白質微陣列、微孔板蛋白質芯片、三維凝膠塊芯片。應用于基因表達的篩選、抗原抗體檢測、篩選及研究、生化反應檢測、藥物篩選、疾病診斷等。優(yōu)點是直接分析粗生物樣品，如血清、尿、體液等，同時快速發(fā)現多個生物標記物，小量樣品，高通量的驗證能力，發(fā)現低豐度蛋白質，測定疏水蛋白質，在同一系統中集發(fā)現和檢測為一體，特異性高，減少測定蛋白質序列的工作量，可以定量，功能廣，可測定細胞內的抗原，而且靈敏度高［10-11］。蛋白芯片技術與質譜技術相結合，展現出獨特的優(yōu)勢。

多維色譜，是利用不同物質，在不同相態(tài)下的選擇性分布，以流動相洗脫固定相中的混合物。在色譜分析中，一旦遇到難分離的物質對，首先考慮改變固定相的選擇性。高度復雜混合物，可能包含不同沸點、不同極性的化合物。更換色譜柱，其中的部分物質分離效果就會得到改善，其它物質的分離效果可能變差。要改善總體分離效果，就需要采用多維氣相色譜。原理是兩根獨立控制、極性不同的色譜柱，通過切換手段，將第一根色譜柱的餾分，選擇性地轉移到第二根色譜柱，進行二次分離，以獲得比單柱更強大的分離能力。多維色譜技術在峰容量方面提供了更廣闊的空間，其中多維氣相色譜和多維液相色譜較為常用。根據樣品組分的性質差別，選擇幾種色譜分離模式組合，對樣品進行分離，與質譜技術聯合，獲得分子量信息，用以分析蛋白質［12-13］。多維液相色譜具有高分辨率、高靈敏度和高速度等優(yōu)點，可用于分離復雜樣品，并可廣泛應用于生物大分子等復雜樣品的分析及分離鑒定，是蛋白質組學研究技術中的重要方法之一。

3　臨床應用

癌癥的發(fā)生，是環(huán)境與遺傳等多重因素，相互作用，激活體內原癌基因，導致抑癌基因失活，或表達被抑制，細胞失去原有的生理調節(jié)，產生異常增生。應用蛋白質組學技術，能系統、全面、動態(tài)地分析癌癥樣本蛋白質種類與含量，結合腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的分子作用網絡，闡明癌癥發(fā)生機制，尋找不同腫瘤的診斷、治療、預后的特異性標志物，為臨床醫(yī)療提供線索與依據。為了研究肝癌的發(fā)生、發(fā)展機制，應用蛋白質組學方法，對患者人源性肝癌組織與正常人體肝組織之間的蛋白質進行比對分析，發(fā)現RAS-RAF-MEK-ERK信號通路與肝癌發(fā)生、發(fā)展機制有相關性。通過對肝癌患者肝組織標本的細胞株進行蛋白質研究，發(fā)現轉移性肝癌患者，肝組織樣本的細胞株中，AGR2表達異常增高，推測AGR2的過度表達，可促進肝癌轉移。使用液相色譜串聯質譜和二維熒光差異凝膠電泳法，檢測不同分化程度的胃腺癌患者，分析出腫瘤組織中差異表達的蛋白質。用定量聚合酶鏈式反應、蛋白質印跡法技術，對結果進行驗證，確認這些因子的表達水平，與蛋白質組學鑒定結果一致，不同分化程度胃腺癌中的蛋白表達，存在顯著差異性，差異蛋白質所對基因，與胃腺癌的發(fā)生以及分化程度相關。使用定量蛋白質組學技術，對金雀異黃素誘導蛋白在胃癌細胞中的改變與具有抗癌作用的染料木素的分子機制進行分析，顯示KIF20A在染料木黃酮的防癌作用中發(fā)揮了重要作用，可能是胃癌藥物治療干預的分子靶點。比較MKN45胃癌細胞株和敲除了CXCR1基因的MKN45細胞，分析二者之間的蛋白質表達譜變化，發(fā)現CXCR1在胃癌的侵襲、增殖、轉移、耐藥、預后等方面，發(fā)揮重要作用。利用液體芯片-飛行時間質譜技術，檢測健康志愿者、食管癌患者的血清，作蛋白質組學分析，發(fā)現患者體內細絲1、微管蛋白β鏈、細胞色素b-c1復合亞基、α-異構體等，表達明顯增高，這些表達失調的蛋白質/多肽，可能參與了食管癌的發(fā)病機制，可作為食管鱗狀細胞癌血清學診斷的生物標志物。利用蛋白質組學技術，對外周血蛋白譜進行分析比較，對差異表達的蛋白質，應用MALDI-TOF-MS技術進行鑒定，發(fā)現慢性胰腺炎患者、胰腺癌患者、胰腺癌病情得到控制的患者，表達存在顯著性差異，用WesteRn Blot法再次驗證，發(fā)現識別體蛋白C3可作為胰腺癌特異性血清標志物。乳腺囊性疾病是誘發(fā)乳腺癌的乳腺良性病變，應用MALDI-TOF質譜分析法，研究后來發(fā)展成乳腺癌的GCDB患者，進行凍存血清分析，發(fā)現實驗組與對照組相比，C3f片段有顯著增加，認為C3f可作為預測指標，用于健康人群和有癌前病變婦女患乳腺癌風險的評估［14-15］。

4　結語

蛋白質組學是揭示生命現象和規(guī)律的有效技術方法，已經廣泛應用于生命科學研究的各個領域，已成為當前生命科學研究與生物技術探索的重要戰(zhàn)略前沿和主要突破口。蛋白質組學研究的技術與應用，為癌癥等疑難疾病的研究開辟了新途徑，對揭示癌癥的發(fā)生、發(fā)展機理有重要意義。利用蛋白質組學技術，可觀察到癌癥早期侵襲、免疫逃逸、發(fā)生、發(fā)展、血管形成和轉移等變化。早期發(fā)現癌癥生物標志物，確立藥物治療靶點，消除耐藥，有利于提高臨床療效。高通量蛋白質組學技術，為更多蛋白質相關變化疾病的研究提供了技術基礎。蛋白質組學研究的原理、技術與應用，已經受到生命科學與生物學界的廣泛關注，有良好的發(fā)展與運用前景。

［1］Wilkina MR，Pasquali C， Appel RS， et al.Fom proteins toproteomes： large-scale protein identification bytwo-dimensional electrophoresis and amino acid analysis.Biotechnology （NY），1996.14（1）：61-65.

［2］Sun H，Chen GY，Yao SQ. Recent advances in microarray technologies for proteomics［J］.ChemBiol，2013， 20（ 5）： 685-699.

［3］LIU Junlian，LIYongzhi， GAO Jianyi， et al. The Progress of the Proteomic Technology.SpaceMedicine&MedicalEngineering，2009， 22（2）：151 - 156.

［4］ZHONG Jingmin， LI Jing， LIU Zhihong， et al.Advances in the Proteomic Technology Application in Malignancy Research［J］. Progress in Modern Biomedicine.2015，15（18）：3593-3596.

［5］Grandjean M，Dieu M，Raes M，et al. A new method combining sequential immunoaffinity depletion and differential in gel electrophoresis to identify autoantibodies as cancer biomarkers［J］. JImmunol Methods，2013，396（ 1-2）： 23-32.

［6］Hortin GL. The MALDI-TOF mass spectrometric view of the plasmaproteome and peptidome［J］.ClinChem，2006，52（ 7）： 1223-1237.

［7］Park J，BlickRH. A Silicon NanomembraneDetectorfor Matrix-AssistedLaser Desorption /Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry（MALDI-TOF MS） of Large Proteins［J］. Sensors（ Basel），2013，13（ 10）： 13708-13716.

［8］Young JY，Feng Z，Dimitropoulos D，et al. Chemical annotation ofsmall and peptide-like molecules at the Protein Data Bank［J］. Database（Oxford）， 2013，2013： bat079.

［9］Hagglund P，Bunkenborg J，Maeda K， et al.dentification of thioredoxin target disulfides using isotope-coded ffinity tags［J］. Methods MolBiol，2014（ 1072）： 677-685.

［10］Chandra H，Reddy PJ，Srivastava S. Protein microarrays and novel detectionplatforms［J］. Expert Rev Proteomics， 2011，8（ 1）：61-79.

［11］Lottspeich F，Kellermann J. ICPL labeling strategies for proteome Research［J］. Methods MolBiol，2011，753： 55-64.

［12］Xu X，Liu K，Fan ZH.Microscale 2D separation systems forproteomicanalysis［J］. Expert Rev Proteomics， 2012，9（ 2）： 135-147.

［13］Ye L，Wu Q，Dai S，et al. Development of a droplet-interfaced highperformance liquid chromatography-capillary electrophoresis two dimensionalseparation platform［J］. Se Pu， 2011，29（ 9）： 857-861.

［14］Qian Xiujuan，Wu Qiong.Advances in proteomics technology and its application in the study of malignant tumors［J］.Chinese Journal of General Practice ， 2014，22（9）：1478-1481.

［15］WANG Limeng， XIE Liqi， LU Haojie.Isobaric terminal labeling tandem mass spectrometricquantification：A high throughput and accuratebiomarker screening technique［J］.Science China PRESS，2016，61（4-5）：432-441.

Principles，Techniques and Applications of Proteomics

WANG Xinghua1，2， WANG Guang-yao1△，Te Kian Keong2，TehSiew Hoon2，OoiCiat Hui2，YE Ru-jia1，WANG Zhi-hang1
（1.Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu， China，210023 ;2.UniversitiTunku Abdul Rahman， Kajang，Malaysia）

The proteome includes all the proteins expressed by cells or organisms.Proteomics is the study of the characteristics of protein on a large scale, including the level of protein expression, the modification of protein, the interaction between protein and protein.This paper does the study in order to explore the physiological basis of life activity and its inherent law, to understand the occurrence, development and cellular metabolism of the disease, to gain a over-whole and comprehensive understanding of the protein level.It is a further extension of the research of protein （peptide） spectrum and the research of gene product map.The core technology of proteomics is two-dimensional electrophoresis, mass spectrometry and bioinformatics and related technology also relates to the relative and absolute quantitative isotope labeling, protein chip and multidimensional chromatography .It has been widely used in many areas of life science research, especiallyprevention and control of cancer and other harmful disease , and has attracted more and more attention.

Proteomics； Two-dimensional electrophoresis； Mass spectrometry； Bioinformatics； Isotope labeling； Protein chip； Multidimensional chromatography； Cancer

國家中醫(yī)藥管理局重點學科，江蘇省重點學科。Centre for Research in Traditional Chinese Medicine，UTAR.

王興華，資深教授，博士，博士研究生導師，人事部等七部委“百千萬人才工程”國家級一二層次，江蘇省“三三三工程”領軍人才，國家中醫(yī)藥管理局重點學科學術帶頭人，江蘇省重點學科學術帶頭人，江蘇省突出貢獻專家，國務院政府特殊津貼專家。

王光耀,男，博士研究生，碩士，講師，主治中醫(yī)師。