朱小曉 蒙杏澤 黎 艷 蘭 菊 梁 偉 黃文川

(廣西南寧市第二人民醫(yī)院中醫(yī)科，南寧市 530021，E-mail：zhxx78@163.com)

論著·基礎(chǔ)研究

加味溫膽湯對腦缺血再灌注損傷大鼠酪氨酸蛋白激酶2與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響▲

朱小曉 蒙杏澤 黎 艷 蘭 菊 梁 偉 黃文川

(廣西南寧市第二人民醫(yī)院中醫(yī)科，南寧市 530021，E-mail：zhxx78@163.com)

目的 探討加味溫膽湯對腦缺血再灌注損傷(CIRI)大鼠酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。方法 選用健康雄性SD大鼠120只，隨機(jī)分為4組，每組30只。正常對照組無任何干預(yù)；假手術(shù)組僅切開頸部皮膚，暴露左側(cè)頸總動脈；腦缺血再灌注模型組、加味溫膽湯治療組均采用線栓法制備大鼠左側(cè)大腦中動脈腦缺血再灌注模型，然后分別給予蒸餾水灌胃和加味溫膽湯灌胃。分別于缺血再灌注后3、12、24、48、72 h對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能ZeaLonga評分并檢測腦組織JAK2、STAT3蛋白表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 (1)正常對照組及假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)；腦缺血再灌注模型組、加味溫膽湯治療組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，ZeaLonga評分均高于正常對照組及假手術(shù)組(P<0.05)。(2)與正常對照組、假手術(shù)組大鼠相比，各時間點(diǎn)腦缺血再灌注模型組、溫膽湯加味治療組大鼠磷酸化JAK2、磷酸化STAT3灰度值明顯降低(P<0.05)，缺血再灌注后24 h溫膽湯加味治療組磷酸化JAK2、磷酸化STAT3灰度值表達(dá)高于腦缺血再灌注模型組(P<0.05)。(3)與正常對照組及假手術(shù)組大鼠比較，各時間點(diǎn)腦缺血再灌注模型組、加味溫膽湯治療組大鼠腦細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，而缺血再灌注后24 h加味溫膽湯治療組大鼠腦細(xì)胞凋亡率低于腦缺血再灌注模型組(P<0.05)。結(jié)論 腦缺血再灌注引發(fā)JAK2、STAT3 通路激活加重神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡，加味溫膽湯可通過抑制JAK2/STAT3通路活化減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而減輕CIRI。

缺血再灌注；大腦；溫膽湯；酪氨酸蛋白激酶2；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3；細(xì)胞凋亡

缺血性腦血管病是一種嚴(yán)重影響人類健康的常見病，具有發(fā)病率、死亡率、致殘率、復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國腦血管病的發(fā)病率為215.8/10萬，完全性卒中患病率為1 407.6/10萬，短暫性腦缺血患病率為2 191.4/10萬，男性死亡率為65/10萬，女性為61/10萬，存活者中很多患者遺留癱瘓、失語等嚴(yán)重殘疾，給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1]。因此，研究缺血性腦血管病的病理生理機(jī)制，尋找適當(dāng)有效的治療及預(yù)防措施是當(dāng)前醫(yī)學(xué)工作者面臨的迫切而艱巨的任務(wù)。腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)是指缺血腦組織恢復(fù)血液灌注后，腦組織損傷反而加重，表現(xiàn)為神經(jīng)損害體征和形態(tài)學(xué)改變可能會較前更加明顯等。本實(shí)驗觀察溫膽湯加味對CIRI大鼠的酪氨酸蛋白激酶2與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(Janus activated kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)蛋白表達(dá)及其對腦細(xì)胞凋亡的影響，探討溫膽湯加味減輕CIRI的作用機(jī)制，為臨床用藥提供治療理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 選用健康雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量為(300±30)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗中心提供。合格證號：SCXK(桂)2014-0002，10周齡。

1.2 主要試劑 磷酸化(phospho-，p-JAKS)(Y221)PAb、p-STAT3(S727)pAb、TUNEL試劑盒、二步法免疫組化試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。中藥溫膽湯加味顆粒劑(茯苓15 g、半夏10 g、陳皮6 g、竹茹10 g、枳實(shí)10 g、甘草6 g、川芎6 g、三七3 g、黃芪15 g、水蛭 6 g)購于南寧市第二醫(yī)院中藥房，根據(jù)《藥理實(shí)驗方法》[2]換算成300 g(體重)大鼠用量：茯苓0.40 g、半夏0.27 g、陳皮0.16 g、竹茹0.27 g、枳實(shí)0.27 g、甘草0.16 g、川芎0.16 g、三七0.08 g、黃芪0.40 g、水蛭0.16 g，結(jié)合大鼠日常進(jìn)水量于灌胃前將每付中藥溶于4 ml蒸餾水中。

1.3 研究方法

1.3.1 實(shí)驗分組：采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠120只分成4組，每組30只。正常對照組無任何干預(yù)；假手術(shù)組僅切開頸部皮膚，暴露左側(cè)頸總動脈；腦缺血再灌注模型組建立缺血再灌注模型，于缺血再灌注后給予蒸餾水灌胃，2 ml/次；加味溫膽湯治療組：建立缺血再灌注模型后給予加味溫膽湯灌胃2次/d。

1.3.2 缺血再灌注動物模型的制備：參考ZeaLonga線栓法[3]，用尼龍魚線栓塞左側(cè)大腦中動脈，建立大腦中動脈缺血模型：用10%水合氯醛0.35 ml/100 g(體重)腹腔內(nèi)注射麻醉，成功后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，術(shù)區(qū)備皮，0.5%碘伏消毒，鋪洞巾。取頸部正中縱切口，依次暴露頜下腺、胸鎖乳突肌、肩胛舌骨肌，分別用自制小拉鉤拉向兩旁固定，選取左側(cè)大腦中動脈做缺血側(cè)，右側(cè)為正常對照。分離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈及其分支甲狀腺上動脈、枕動脈、頸內(nèi)動脈及其分支翼腭動脈，結(jié)扎并切斷頸外動脈分支甲狀腺上動脈和枕動脈，需特別注意不要損傷喉上神經(jīng)和喉返神經(jīng)，用翼腭鉤鉤取翼腭動脈，3-0手術(shù)線靠近根部結(jié)扎，暫留取線頭以供提拉用，于頸外動脈分出甲狀腺上動脈和枕動脈后的遠(yuǎn)端(約距頸總動脈分叉處5～7 mm)，結(jié)扎頸外動脈，隨后于頸內(nèi)動脈和頸總動脈分別放置顯微動脈夾，在頸外動脈斷端距動脈分叉3 mm處的動脈壁上用顯微手術(shù)剪刀側(cè)切小口，插入備用線栓，頭端至頸總動脈分叉處調(diào)整線栓走向，使其與頸內(nèi)動脈呈平行線，移去頸內(nèi)動脈夾，線栓至頸內(nèi)動脈顱內(nèi)段時迅速推進(jìn)，遇輕微阻力即可，線栓插入深度約20 mm(從左頸總動脈分叉處計算，若誤入翼腭動脈中尼龍魚線插入15 mm長度即有阻力，不能繼續(xù)插入)，即可阻斷左側(cè)大腦中動脈，引起左側(cè)大腦中動脈阻斷。然后扎緊頸外動脈，以防線栓移位及出血，血管外留線約10 mm，移去頸總動脈夾，觀察無滲血，縫合皮膚。缺血2 h后再灌注：抽出尼龍魚線，使其頭端退回到頸外動脈主干內(nèi)，恢復(fù)左側(cè)大腦中動脈供血，若動物已清醒則需再次麻醉，以防拔線時動物掙扎而引起血管破裂。將麻醉蘇醒后的大鼠放回鼠籠，單籠飼養(yǎng)，自由飲食。

1.3.3 神經(jīng)功能評分：(1)一般行為觀察：分別于術(shù)后3、12、24、48、72 h觀察神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，肢體癱瘓、轉(zhuǎn)圈等，并作提尾懸空試驗。有痙攣和意識障礙的大鼠則剔除。(2)參考大腦中動脈局灶缺血模型神經(jīng)功能ZeaLonga評分[3]標(biāo)準(zhǔn)：0分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾斜；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.3.4 腦標(biāo)本采集：分別于缺血再灌注后3、12、24、48、72 h，每組各處死6只大鼠，快速斷頭取腦，置于冰盤上，取大腦半球頂葉皮質(zhì)及海馬腦組織，用4%多聚甲醛/0.1M磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)固定液固定2 h后常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，待切片用。

1.3.5 檢測腦組織JAK2、STAT3蛋白表達(dá)：采用免疫組織化學(xué)染色法檢測。將蠟塊冠狀切片，每張切片厚約 2 μm，切片后依次撈片，烤片12 h，脫蠟(二甲苯10 min→二甲苯10 min→二甲苯10 min→無水酒精2 min→無水酒精2 min→90%乙醇2 min→70%乙醇2 min→3%雙氧水15 min→蒸餾水3 min)；PBS洗3次，2 min/次，熱修復(fù)約2 min，PBS洗3次，2 min/次，血清封閉后室溫放置15 min，加抗體，釆用免疫組化法(SV002兔-IgG-兩步法)檢測p-JAK2和p-STAT3的蛋白表達(dá)，以p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)情況來表示JAK2、STAT3蛋白表達(dá)水平；操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。封片后于顯微鏡下觀察，細(xì)胞胞漿、胞核染為棕褐色或有棕褐色顆粒沉積者為p-JAK2蛋白陽性表達(dá)，以細(xì)胞核染為棕褐色或有棕褐色顆粒沉積者為p-STAT3蛋白陽性表達(dá)。用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測量陽性細(xì)胞的平均灰度值，其灰度值與p-JAK2、p-STAT3免疫陽性細(xì)胞數(shù)成反比。

1.3.6 細(xì)胞凋亡檢測：將石蠟包埋后冠狀切片，厚約2 μm，切片后，撈片，烤片12 h，脫蠟；切片中加入用PBS溶液稀釋過蛋白酶K，用37℃的孵箱孵育10 min后，再用PBS溶液洗3次，5 min/次；然后每張切片中加入標(biāo)記緩沖液20 μl左右，保證液體覆蓋住腦組織切片，防止腦組織干片。然后按1 ∶20配置末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶與地高辛標(biāo)記液，將其混勻。再除去切片上多余的液體，重新給每張片加標(biāo)記液，加完后將切片放在濕盒中，用37℃的恒溫箱孵育2 h，PBS溶液洗3次，3 min/次；加封閉液，確保封閉液覆蓋住腦組織切片，放在室溫下，30 min；甩掉腦組織切片表面的封閉液，腦組織切片上加入提前配好的抗地高辛抗體溶液，將有腦組織的載玻片放在濕盒中，用37℃的孵箱孵育30 min，PBS溶液洗3次，3 min/次，加提前配好的鏈霉親和素-生物復(fù)合物溶液，37℃孵育30 min，PBS溶液洗5次，4 min/次，DAB顯色，顯色需在暗室內(nèi)，顯色完畢后需用水洗，用蘇木素復(fù)染，蒸餾水洗，透明，封片，顯微鏡觀察。細(xì)胞的胞核被染為棕黃色或有棕黃色顆粒沉積者則為凋亡細(xì)胞。以400倍鏡視野的顯微鏡為標(biāo)準(zhǔn)，每張標(biāo)本片中選5個不重復(fù)的視野，且計算出每個視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)，算出凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 正常對照組、假手術(shù)組未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，各時間點(diǎn)神經(jīng)功能ZeaLonga評分均為0分。腦缺血再灌注模型組、加味溫膽湯治療組大鼠在術(shù)后3、12、24、48、72 h均出現(xiàn)不同程度的肢體活動障礙，精神狀態(tài)差，進(jìn)食及活動均減少，與正常對照組、假手術(shù)組比較，腦缺血再灌注模型組、加味溫膽湯治療組大鼠神經(jīng)功能缺損ZeaLong評分明顯升高(P<0.05)；各時間點(diǎn)，腦缺血再灌注模型組大鼠與加味溫膽湯治療組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 缺血再灌注后不同時點(diǎn)各組神經(jīng)功能評分比較(x±s，分)

注： 與正常對照組、假手術(shù)組比較，*P<0.05。

2.2 各組大鼠腦組織p-JAK2、STAT3灰度值比較 與正常對照組、假手術(shù)組大鼠相比，腦缺血再灌注模型組、溫膽湯加味治療組大鼠p-JAK2、p-STAT3灰度值明顯降低(P<0.05)；缺血灌注后24 h溫膽湯加味治療組p-JAK2、p-STAT3灰度值表達(dá)高于腦缺血再灌注模型組(P<0.05)。見表2、表3。

表2 缺血再灌注后不同時點(diǎn)各組JAK2灰度值(x±s)

注：與正常對照組、假手術(shù)組比較，*P<0.05；與腦缺血再灌注模型組比較，▲P<0.05。

表3 缺血再灌注后不同時點(diǎn)各組p-STAT3灰度值(x±s)

注：與正常對照組、假手術(shù)組比較，*P<0.05；與腦缺血再灌注模型組比較，▲P<0.05。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 與正常對照組及假手術(shù)組大鼠比較，腦缺血再灌注模型組、加味溫膽湯治療組大鼠腦細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，而加味溫膽湯治療組大鼠腦細(xì)胞凋亡率低于腦缺血再灌注模型組(P<0.05)。見表4。

表4 缺血再灌注后不同時點(diǎn)各組腦細(xì)胞凋亡率比較(x±s，%)

注：與正常對照組、假手術(shù)組比較，*P<0.05；與腦缺血再灌注模型組比較，▲P<0.05。

3 討 論

CIRI是一個快速的級聯(lián)反應(yīng)，這個級聯(lián)反應(yīng)包括許多環(huán)節(jié)，可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性作用、鈣超載、細(xì)胞凋亡等有關(guān)。這些環(huán)節(jié)互為因果，彼此重疊，并相互聯(lián)系，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。已有研究證實(shí)，CIRI后誘導(dǎo)許多細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，并在腦缺血病理生理中扮演著重要角色，其中包括白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子-α等[4]。腦缺血開啟了細(xì)胞的一系列級聯(lián)反應(yīng)事件，包括不同的信號通路，最終引起不可逆的腦組織損傷，導(dǎo)致腦梗死。腦細(xì)胞缺氧后產(chǎn)生大量自由基，對細(xì)胞造成了氧化應(yīng)激損傷。再灌注可提供營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，但同時也使神經(jīng)細(xì)胞炎癥級聯(lián)反應(yīng)加重，使腦細(xì)胞受損嚴(yán)重。氧化損傷、免疫炎癥介質(zhì)釋放、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺失與釋放、鈣超載等都與CIRI病程及損傷程度密切相關(guān)，是CIRI后致畸致殘的主要原因。

近年研究表明JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及神經(jīng)細(xì)胞的增殖、生存、分化過程[5]，且該信號途徑活化是加重CIRI的病理生理機(jī)制之一。故抑制該通路異常活化可能是減輕CIRI的一個重要策略。JAK/STAT 通路的作用是將細(xì)胞外信號傳遞到細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)[6]。研究表明大鼠CIRI側(cè)腦組織額頂葉皮質(zhì)及紋狀體p-JAK2、p-STAT3表達(dá)明顯增高，并且與神經(jīng)凋亡細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，說明腦缺血再灌注后JAK2、STAT3被激活，活化的STAT3漸移向核內(nèi)，與目的基因的啟動子結(jié)合，直接激活目的基因表達(dá)[5]。Suzuki等[7]觀察SD大鼠局灶性腦缺再灌注損傷后p-STAT3蛋白在腦組織中表達(dá)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后3 h在缺血皮層及紋狀體神經(jīng)元可檢測到p-STAT3蛋白表達(dá)；再灌注損傷24 h后p-STAT3蛋白在缺血半暗帶區(qū)顯著增多并達(dá)高峰；此后隨著再灌注時間延長p-STAT3蛋白表達(dá)漸減少。Wen等[8]的研究表明CIRI后引發(fā)JAK2/STAT3通路激活及表達(dá)增多與神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡有關(guān)，故抑制該通路活化可成為臨床治療CIRI的理論基礎(chǔ)。

自擬方加味溫膽湯(茯苓、半夏、陳皮、竹茹、枳實(shí)、甘草、川芎、三七、黃芪、水蛭)是在溫膽湯的基礎(chǔ)上加川芎、三七、水蛭等活血化瘀中藥組成，有化痰祛濕、活血通絡(luò)的作用，臨床上常用于缺血性卒中的治療。蔣敏[9]發(fā)現(xiàn)加味溫膽湯可促進(jìn)缺血腦組織血管新生從而改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能。王蓓[10]則發(fā)現(xiàn)黃芪和三七可通過抑制JAK、STAT通路激活而有效對抗CIRI。本實(shí)驗通過建立腦缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)CIRI大鼠JAK2/STAT3蛋白表達(dá)增高，神經(jīng)凋亡細(xì)胞增多，于24 h達(dá)峰值，后逐漸逐漸降低。用加味溫膽湯干預(yù)后，在腦缺血再灌注后24 h時JAK2/STAT蛋白較腦缺血再灌注模型組表達(dá)明顯減少，同時神經(jīng)細(xì)胞凋亡亦明顯減少。提示加味溫膽湯可通過抑制JAK2/STAT3通路減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而減輕CIRI。

綜上所述，加味溫膽湯可通過多種機(jī)制發(fā)揮對抗CIRI的作用，本實(shí)驗研究證明，抑制JAK2/STAT3通路活化可能是其減輕CIRI的機(jī)制之一。

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Effect of Jiaweiwendan Decoction on expressions of janus activated kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3 proteins and cell apoptosis in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury

ZHUXiao-xiao,MENGXing-ze,LIYan,LANJu,LIANGWei,HUANGWen-chuan

(DepartmentofTraditionalChineseMedicine,theSecondPeople′sHospitalofNanning,Nanning530021,China)

Objective To investigate the effect of Jiaweiwendan Decoction on the expressions of janus activated kinase 2(JAK2)/signal transducer and activator of transcription 3(STAT3) proteins and cell apoptosis in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods A total of 120 healthy male SD rats were randomly divided into 4 groups,with 30 rats in each group.No intervention was conducted in the normal control group.In the sham-operation group,an incision was performed in the neck skin and left common carotid artery was exposed.Rat models of left middle cerebral artery ischemia-reperfusion injury were established using suture embolization method in the cerebral ischemia-reperfusion group and Jiaweiwendan Decoction group.Intragastric administration with distilled water and Jiaweiwendan Decoction were performed in the cerebral ischemia-reperfusion group and Jiaweiwendan Decoction group respectively.At 3,12,24,48 and 72 hours after ischemia-reperfusion,Zealonga score for neurological function was assessed,the expressions of JAK2/STAT3 proteins and nerve cell apoptosis were detected in each group.Results ① No neurological function impairment was found in the normal control group and sham-operation group.In the cerebral ischemia-reperfusion group and Jiaweiwendan Decoction group,neurological function impairment was observed,and the Zealonga scores were significantly higher compared to the normal control group and sham-operation group(P<0.05).② At each time point,the cerebral ischemia-reperfusion group and Jiaweiwendan Decoction group obtained significantly lower gray values of JAK2 and STAT3 compared to the normal control group or sham-operation group(P<0.05),and the gray values of JAK2 and STAT3 in the Jiaweiwendan Decoction group were higher than those in the cerebral ischemia-reperfusion group(P<0.05).③ At each time point,the cerebral ischemia-reperfusion group and Jiaweiwendan Decoction group obtained significantly higher apoptosis rate of brain cells compared to the normal control group or sham-operation group(P<0.05),and the apoptosis rate in the Jiaweiwendan Decoction group were lower than that in the cerebral ischemia-reperfusion group(P<0.05).Conclusion Cerebral ischemia-reperfusion can activate the JAK2/STAT3 pathway and then aggravates the injury and apoptosis of brain cells.Jiaweiwendan Decoction can reduce the cell apoptosis by suppressing the activation of JAK2/STAT3 pathway,and then alleviates the cerebral ischemia-reperfusion injury.

Ischemia-reperfusion,Brain,Jiaweiwendan Decoction,Janus activated kinase 2,Signal transducer and activator of transcription 3,Apoptosis

廣西南寧市科技攻關(guān)計劃(ZC20133004)

朱小曉(1964～)，女，本科，主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)心腦血管疾病。

R 743.31

A

0253-4304(2016)07-0906-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.07.03

2016-02-29

2016-05-13)