莫瑞祥 楊 威 李西融 廖文勝 張慧明 陳澤峰 黃 芳

(廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院1 外一科，2 病理科，桂林市 541002，E-mail：moruixiang@126.com)

論著·臨床研究

p28GANK蛋白在肝細胞性肝癌組織中的表達及其臨床意義▲

莫瑞祥1楊 威1李西融2廖文勝1張慧明1陳澤峰1黃 芳1

(廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院1 外一科，2 病理科，桂林市 541002，E-mail：moruixiang@126.com)

目的 探討p28GANK蛋白在肝細胞性肝癌(HCC)組織中的表達及其臨床意義。方法 收集HCC組織及其相應癌旁組織60例(其中32例伴有肝硬化組織)、正常肝組織30例，采用免疫組化法檢測HCC、癌旁組織、肝硬化組織、正常肝組織組織中p28GANK蛋白的表達，分析p28GANK蛋白表達水平與HCC患者臨床病理特征關系。結果 p28GANK蛋白在HCC、癌旁肝組織、肝硬化組織性、正常肝組織陽性表達率分別為71.7%、10.0%、12.5%、6.7%，HCC中p28GANK蛋白的陽性表達率高于其他組織(P<0.05)。HCC患者中，低分化(Ⅲ～Ⅳ級)、淋巴結和(或)遠處轉移及TNM分期Ⅲ+Ⅳ者p28GANK蛋白表達陽性率分別高于高分化(Ⅰ～Ⅱ級)、無淋巴結和(或)遠處轉移、TNM分期Ⅰ+Ⅱ者(P<0.05)。結論 p28GANK蛋白表達可能與HCC的發(fā)生發(fā)展有關，p28GANK可作為HCC診斷的分子標志物。

肝腫瘤；p28GANK基因；蛋白

原發(fā)性肝癌是常見惡性腫瘤之一，在我國惡性腫瘤死亡率中居第二位，在廣西原發(fā)性肝癌仍然是最主要的惡性腫瘤。肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發(fā)生可能與HBV、HCV、黃曲霉毒素B1等致癌因子通過癌基因的改變而起作用，如N-ras基因、C-myc，C-fos等癌基因激活及p53抑癌基因失活有關。分子機制研究表明，p28GANK基因主要通過Rb、鼠雙微基因2(murine double mimute 2，MDM2)-p53等重要信號途徑，調(diào)控細胞周期進程、促進細胞增殖并抑制細胞凋亡[1-3]，提示該基因在細胞增殖和腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有極為重要的作用。本研究通過檢測并對比HCC、癌旁組織、肝硬化組織及正常肝組織中p28GANK基因表達產(chǎn)物的表達情況，同時分析HCC組織中p28GANK蛋白表達與臨床病理因素的關系，探討p28GANK基因在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 選取2010年1月至2015年12月廣西區(qū)南溪山醫(yī)院病理科存檔的蠟塊標本，包括HCC及其相應癌旁組織60例(其中32例伴有肝硬化組織)、正常肝組織30例，所有病例均為未接受放療和化療治療。HCC病例中，男性37例，女性23例，年齡22～72歲，中位年齡40歲；Edmondson-Steiner分級[4]Ⅰ級14例，Ⅱ級15例，Ⅲ級18例，Ⅳ級13例；TNM分期[4]Ⅰ期10例，Ⅱ期12例，Ⅲ期20例，Ⅳ期18例。32例HCC伴有肝硬化病例中男性21例，女性11例，年齡28～72歲，中位年齡43歲。正常肝組織來源于肝膽外傷手術切除患者，其中男性22例，女性8例，年齡21～63歲，中位年齡38歲。HCC、肝硬化及正常肝組織患者的性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有標本均經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片厚4 μm。

1.2 主要試劑 兔抗人p28GANK單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品(生產(chǎn)批號：20130458)，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶聯(lián)結(streptavidin-perosidase，SP)法即用型抗兔免疫組織化學超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒、正常非免疫羊血清和二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒購于福州邁新生物技術開發(fā)有限公司(生產(chǎn)批號：1506030031)。

1.3 免疫組織化學S-P法染色及結果評估 組織芯片切片脫蠟、水化后，置入3% H2O2中室溫30 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，正常非免疫羊血清室溫封閉30 min，滴加p28GANK單克隆抗體(濃度1 ∶50)，置密封濕盒中4°C過夜，滴加即用型生物素標記二抗和標記過氧化物酶的鏈霉菌抗生物素蛋白，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。用已知陽性的結腸腺癌切片作陽性對照，磷酸緩沖鹽溶液代替一抗作陰性對照。結果評估參照文獻[5]報告的方法，由兩位未知患者臨床病理資料的資深病理醫(yī)師顯微鏡下獨立觀察，p28GANK免疫組化染色陽性物質定位于細胞質和胞核。每例標本至少隨機觀察3個視野(×200)，根據(jù)陽性細胞比例和染色強度判定染色結果。無陽性細胞記0分，陽性細胞<30%記1分，30%～60%記2分，>60%記3分；無染色記0分，弱陽性記1分，陽性記2分，強陽性記3分。兩項評分分值相加，0～2分為p28GANK表達陰性，3～6分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料間比較采用χ2檢驗或精確概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 p28GANK蛋白在HCC、癌旁肝組織、肝硬化組織及正常肝組織中的表達情況 p28GANK蛋白陽性表達信號為棕黃色細小顆粒狀，定位于細胞核和細胞質。p28GANK蛋白在HCC、癌旁組織、肝硬化組織及正常肝組織的表達情況見圖1。HCC中p28GANK蛋白的表達高于癌旁組織、肝硬化組織及正常肝組織(χ2=73.167，P<0.001)，見表1。

圖1 p28GANK蛋白在HCC、癌旁肝組織、肝硬化組織及正常肝組織中的表達(親和組化染色法，×400)

注：與HCC組織比較，*P<0.05。

2.2 p28GANK蛋白表達水平與HCC患者臨床病理特征關系 不同分化程度的患者肝癌組織p28GANK蛋白表達陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，低分化(Ⅲ～Ⅳ級)的患者p28GANK蛋白表達陽性率高于高分化(Ⅰ～Ⅱ級)的患者；淋巴結和(或)遠處轉移的患者肝癌組織p28GANK蛋白表達陽性率高于無淋巴結和(或)遠處轉移的患者(P<0.05)；TNM分期Ⅲ+Ⅳ的患者肝癌組織p28GANK蛋白表達陽性率高于Ⅰ+Ⅱ的患者(P<0.05)。見表2。

表2 HCC患者肝癌組織p28GANK蛋白與臨床病理特征關系(n，%)

3 討 論

p28GANK系日本科學家Fujita等應用消減雜交法從人HCC組織高表達的基因中篩選出一條編碼重復gankyrin序列的新基因，并在人胎盤cDNA文庫中克隆出它的全長cDNA序列，該序列在哺乳動物中高度保守[6]。gankyrin基因cDNA全長約1.5 kb，開放閱讀框編碼一個226氨基酸組成的蛋白質，分子量約為25 kDa。p28GANK 分子表面有凹槽，可以與其他蛋白質分子相互作用，因此，具有多種生物學功能[7]。MDM2-p53通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，MDM2在多數(shù)腫瘤細胞中有促進細胞惡性轉變潛能，它可以與腫瘤抑制基因p53結合進而降低其活性，而p28GANK能夠與MDM2 N-端RING結構域結合激活后者引起構象變化，從而發(fā)揮與p53結合功能，促進p53泛素化而降解，促進細胞增殖并抑制細胞凋亡，導致腫瘤細胞惡性轉化[8-10]。Rb蛋白能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖、凋亡等多種惡性生物學行為，p28GANK過表達可以促進Rb磷酸化，使其出核后在胞漿降解[11-12]。

研究表明，p28GANK在消化道腫瘤中普遍呈高表達，p28GANK在食管癌、結腸癌等[5，13]組織中表達均高于癌旁或正常組織，并且在食管癌中p28GANK表達與腫瘤組織大小及預后明顯相關[13]，結腸癌組織p28GANK表達與腫瘤浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移、Dukes分期及術后生存期相關[5]。為探討p28GANK與HCC發(fā)生、發(fā)展的關系，我們應用免疫組化法檢測p28GANK蛋白在HCC、癌旁組織、肝硬化組織及正常肝組織的表達，結果顯示，HCC中p28GANK蛋白的陽性表達率明顯高于癌旁組織、肝硬化組織及正常肝組織(P<0.05)，提示HCC的發(fā)生可能與p28GANK蛋白表達上調(diào)相關，p28GANK在HCC發(fā)生中起重要作用。對p28GANK蛋白表達水平與HCC患者臨床病理特征的關系分析結果顯示，低分化(Ⅲ～Ⅳ級)、淋巴結和(或)遠處轉移及TNM分期Ⅲ+Ⅳ的患者肝癌組織p28GANK蛋白表達陽性率分別高于高分化(Ⅰ～Ⅱ級)的患者、無淋巴結和(或)遠處轉移、TNM分期Ⅰ+Ⅱ的患者(P<0.05)，提示p28GANK蛋白表達陽性可能與腫瘤分化程度、淋巴結和(或)遠處轉移、TNM分期有關，說明p28GANK對HCC的惡性進展具有促進作用。上述結果與p28GANK在食管癌[12]、結腸癌[4]研究中的結果相似。

綜上所述，p28GANK可能參與了HCC發(fā)生過程并且對腫瘤惡性進展具有促進作用，這為研究HCC的發(fā)病機制提供了新的線索，同時也為HCC診斷提供分子靶標。

[1] Higashitsuji H,Liu Y,Mayer RJ,et al.The oncoprotein gankyrin negatively regulates both p53 and RB by enhancing proteasomal degradation[J].Cell Cycle,2005,4(10):1 335-1 337.

[2] Sdek P,Ying H,Chang DL,et al.MDM2 promotes proteasome-dependent ubiquitin-independent degradation of retinoblastoma protein[J].Mol Cell,2005,20(5):699-708.

[3] Rezvani K,Mee M,Dawson S,et al.Proteasomal interactors control activities as diverse as the cell cycle and glutaminergic neurotransmission[J].Biochem Soc Trans,2003,31(2):470-473.

[4] 中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會,中國抗癌協(xié)會臨床腫瘤學協(xié)作委員會,中華醫(yī)學會肝病學分會肝癌學組.原發(fā)性肝癌規(guī)范化診治的專家共識[J].臨床腫瘤學雜志,2009,14(3):259-269.

[5] 蔡煒龍,許洪寶,汪偉民.p28GANK在結腸癌中的表達及其意義[J].胃腸病學,2013,18(2):105-108.

[6] Higashitsuji H,Itoh K,Nagao T,et al.Reduced stability of retinoblastoma protein by gankyrin,an oncogenic ankyrin-repeat protein overexpressed in hepatomas[J].Nat Med,2000,6(1):96-99.

[7] Krzywda S,Brzozowski AM,Higashitsuji H,et al.The crystal structure of gankyrin,an oncoprotein found in complexes with cyclin-dependent kinase 4,a 19 S proteasomal ATPase regulator,and the tumor suppressors Rb and p53[J].J Biol Chem,2004,279(2):1 541-1 545.

[8] Momand J,Zambetti GP,Olson DC,et al.The mdm-2 oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation[J].Cell,1992,69(7):1 237-1 245.

[9] Zheng N,Wang P,Jeffrey PD,et al.Structure of a c-Cbl-UbcH7 complex:RING domain function in ubiquitin-protein ligases [J].Cell,2000,102(4):533-539.

[10]Higashitsuji H,Higashitsuji H,Itoh K,et al.The oncoprotein gankyrin binds to MDM2/HDM2,enhancing ubiquitylation and degradation of p53[J].Cancer Cell,2005,8(1):75-87.

[11]Stevaux O,Dyson NJ.A revised picture of the E2F transcriptional network and RB function[J].Curr Opin Cell Biol,2002,14(6):684-691.

[12]Tan L,Fu XY,Liu SQ,et al.Expression of p28GANK and its correlation with RB in human hepatocellular carcinoma[J].Liver Int,2005,25(3):667-676.

[13]Tang SH,Yang GT,Meng Y,et al.Overexpression of a novel gene gankyrin correlates with the malignant phenotype of colorectal cancer[J].Cancer Biol Ther,2010,9(2):88-95.

Expression of p28GANK protein in hepatocellular carcinoma tissues and its clinical significance

MORui-xiang1,YANGWei1,LIXi-rong2,LIAOWen-sheng1,ZHANGHui-ming1,CHENZe-feng1,HUANGFang1

(1TheFirstDepartmentofSurgery,2DepartmentofPathology,NanxishanHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Guilin541002,China)

Objective To explore the expression of p28GANK protein in hepatocellular carcinoma(HCC) tissues and its clinical significance.Methods Sixty specimens of HCC tissues and matched para-carcinoma tissues(32 of which contained hepatocirrhosis),30 specimens of normal liver tissues were collected.Immunohistochemistry was used to detect the protein expression of p28GANK in HCC tissues,para-carcinoma tissues,hepatocirrhosis tissues and normal liver tissues.The relationship between the expression level of p28GANK protein and clonicopathological features of patients with HCC was analyzed.Results The positive expression rates of p28GANK protein in HCC tissues,para-carcinoma tissues,hepatocirrhosis tissues and normal liver tissues were 71.7%,10.0%,12.5%,6.7%,respectively.The positive expression rate of p28GANK protein in HCC tissues was significantly higher than that in the other tissues(P<0.05).In the patients with HCC,the positive expression rates of p28GANK protein in the patients with poorly differentiated type(Class Ⅲ-Ⅳ),with lymphatic/distant metastasis,and with TNM stage Ⅲ+Ⅳ were higher than those in the patients with well differentiated type(Class Ⅰ-Ⅱ),without lymphatic/distant metastasis,and with TNM stage Ⅰ+Ⅱ respectively(P<0.05).Conclusion The expression of p28GANK protein might be associated with tumorigenesis and progress of HCC.And p28GANK may become a molecular marker for the diagnosis of HCC.

Liver neoplasms,p28GANK gene,Protein

廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點科研課題(重2012014)

莫瑞祥(1965～)，男，本科，主任醫(yī)師，研究方向：肝膽腫瘤的基礎與臨床研究。

R 735.7

A

0253-4304(2016)07-0919-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.07.07

2016-03-21

2016-05-24)