曾麗平 吳和平 伍世揮 楊美蘭 梁 露

(1 湖南醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，懷化市 418000，E-mail：zengliping2014@126.com；2 湖南醫(yī)藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，懷化市 418000)

論著·臨床研究

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶M1基因缺失與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系▲

曾麗平1吳和平1伍世揮1楊美蘭2梁 露2

(1 湖南醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，懷化市 418000，E-mail：zengliping2014@126.com；2 湖南醫(yī)藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，懷化市 418000)

目的 探討谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)M1基因缺失與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系。方法 結(jié)直腸癌患者86例，應(yīng)用PCR方法檢測(cè)患者術(shù)前外周血液中GSTM1基因。采用Kaplan-Meier法計(jì)算不同GSTM1基因型及臨床病理特征患者的中位生存期，多因素Cox回歸分析結(jié)直腸癌患者死亡的影響因素。結(jié)果 86例患者中，GSTM1(+)32例，GSTM1(-)54例。GSTM1缺失組中位生存期為64.61個(gè)月，短于GSTM1非缺失者的81.92個(gè)月(P<0.05)。GSTM1基因缺失(RR=2.37)、TNM分期(RR=1.86)及腫瘤分化程度(RR=1.58)均是結(jié)直腸癌患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。結(jié)論 GSTM1基因缺失結(jié)直腸癌患者生存期較短，死亡風(fēng)險(xiǎn)較高。腫瘤TNM分期及分化程度也是結(jié)直腸癌患者術(shù)后死亡的危險(xiǎn)因素。

結(jié)直腸癌；谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶M1；生存期；死亡

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例約120萬(wàn)例，死亡約60萬(wàn)例。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變以及人口老齡化的加劇，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率都呈明顯上升的趨勢(shì)[1]。研究證實(shí)結(jié)直腸癌的預(yù)后與TNM分期、治療手段等密切相關(guān)[2]，但在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，盡管結(jié)直腸癌患者具有相同的臨床特征，甚至采取相同的治療手段，其預(yù)后仍有較大的差異。

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)是人體內(nèi)參與生物轉(zhuǎn)化的一組重要的Ⅱ相代謝酶系，幾乎所有的細(xì)胞和組織中都有表達(dá)，其主要功能是催化各種親電子致癌物與谷胱甘肽反應(yīng)，增加其水溶性而利于排出體外，從而發(fā)揮解毒作用。GST主要包括GSTA(α)、GSTM(μ)、GSTT(θ)和GSTP(π)4種同工酶，該酶系中的許多成員的編碼基因都具有基因多態(tài)性。GST基因多態(tài)性導(dǎo)致酶的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而失去解毒能力，從而提高個(gè)體腫瘤易感性，并與腫瘤治療反應(yīng)及生存率相關(guān)。本研究對(duì)86例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行了GSTM1基因型檢測(cè)，探討GSTM1基因缺失與結(jié)直腸癌生存期的關(guān)系，旨在為今后的結(jié)直腸癌的預(yù)后評(píng)估提供一定的理論參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集湖南醫(yī)藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院2005年8月至2012年8月經(jīng)手術(shù)切除并病理確診為結(jié)直腸癌患者。病例入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)腫瘤行根治性切除并經(jīng)病理確診為結(jié)腸癌或直腸癌；(2)未合并其他腫瘤；(3)術(shù)前未經(jīng)放化療；(4)臨床病理特征及術(shù)后隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他腫瘤；(2)臨床病理特征及術(shù)后隨訪資料不完整；(3)非因結(jié)直腸癌死亡者；(4)失訪者。符合上述標(biāo)準(zhǔn)結(jié)直腸癌患者86例，其中男性51例、女性35例，年齡36～82(58.2±12.3)歲。

1.2 資料收集 收集患者的臨床病理資料，包括：年齡、性別、民族、吸煙飲酒狀況、聯(lián)系方式、疾病確診時(shí)間、手術(shù)時(shí)間、術(shù)后病檢報(bào)告、TNM分期和放化療史等。其中不吸煙者定義為不吸煙或者累計(jì)吸煙量<30包-年(包-年為每日吸煙包數(shù)×吸煙年數(shù))，吸煙者定義為累計(jì)吸煙量≥30包-年。飲酒者定義為現(xiàn)在或者曾經(jīng)飲酒100 ml/d，并持續(xù)兩年或者兩年以上者。對(duì)所有研究對(duì)象采用信件、電話或門(mén)診復(fù)查方式進(jìn)行隨訪，自病理確診日期起計(jì)算生存期，止于2015年9月。

1.3 主要試劑及儀器 9600 PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司)，BioDoc凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)，引物序列由上海生工生物技術(shù)股份有限公司合成，Taq DNA聚合酶、三磷酸脫氧核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)、PCR反應(yīng)緩沖液、MgCl2及蛋白酶K均購(gòu)自上海生工生物技術(shù)股份有限公司。

1.4 DNA提取 采集患者術(shù)前晨起空腹外周靜脈血2 ml，儲(chǔ)于乙二胺四乙酸抗凝試管中，采用傳統(tǒng)蛋白酶K消化法，苯酚、氯仿乙醇抽提外周血DNA，置-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 基因檢測(cè) 采用PCR方法檢測(cè)GSTM1基因缺失情況。擴(kuò)增GSTM1引物序列為5′-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3，和5′-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為215 bp。同時(shí)以β-珠蛋白基因作為內(nèi)參照，引物序列為5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3，和5′-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為268 bp。PCR反應(yīng)體系(25 μl)：包括三羥甲基氨基甲烷10 mmol/L，MgCl225 mmol/L，基因組DNA 300 ng，dNTP 混合液2.5 mmol/L，GSTM1引物各5 μmol/L，β-珠蛋白基因引物1 μmol/L，Taq聚合酶1 U。PCR條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃ 60 s，58℃ 60 s，72℃ 60 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)后72℃ 5 min。取產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后置紫外凝膠自動(dòng)成像儀直接觀察結(jié)果。GSTM1(+)即GSTM1非缺失者DNA樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生215 bp片斷，而基因缺失者無(wú)相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，為GSTM1(-)即GSTM1缺失，見(jiàn)圖1。

圖1 GSTM1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

注：M：100 bp DNA Marker；1，6：GSTM1(-)；2，3，4，5：GSTM1(+)

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法計(jì)算中位生存期，Log-rank檢驗(yàn)比較兩組間的差異；采有Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GSTM1基因缺失情況 86例結(jié)直腸癌中，GSTM1(+)32例(37.2%)，GSTM1(-)54例(62.8%)。

2.2 GSTM1基因缺失者及非缺失者的臨床病理特征 為了排除在生存分析時(shí)各種可能影響GSTM1基因分布的因素，先對(duì)GSTM1基因缺失者及非缺失者的臨床病理特征進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，GSTM1基因(-)組吸煙比例、Ⅳ期者比例及腫瘤中高分化者比例低于GSTM1基因(+)組(P<0.05)，吸煙、TNM分期及腫瘤分化程度可能影響GSTM1基因的分布，見(jiàn)表1。

表1 GSTM1基因缺失者及無(wú)缺失者的臨床特征(n，%)

2.3 GSTM1基因及其相關(guān)影響因素對(duì)結(jié)直腸癌患者生存期的影響 TNM Ⅳ期組中位生存期短于Ⅰ～Ⅲ期組(P<0.05)，腫瘤中高分化組中位生存期短于低分化組(P<0.05)，GSTM1(-)組中位生存期短于GSTM1(+)組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同臨床特征的結(jié)直腸癌患者中位生存期比較

2.4 結(jié)直腸癌死亡風(fēng)險(xiǎn)的Cox回歸分析 多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤TNM分期、分化程度及GSTM1缺失是結(jié)直腸癌患者死亡的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。腫瘤TNM分期Ⅳ期結(jié)直腸癌患者的死亡相對(duì)危險(xiǎn)度是Ⅰ～Ⅲ期患者的1.86倍，腫瘤低分化者的死亡相對(duì)危險(xiǎn)度是中高分化者的1.58倍，GSTM1基因缺失結(jié)直腸癌患者的死亡相對(duì)危險(xiǎn)度是GSTM1基因無(wú)缺失者的2.37倍。見(jiàn)表3。

表3 結(jié)直腸癌患者死亡的Cox回歸分析

3 討 論

結(jié)直腸癌是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病，其發(fā)病率位居惡性腫瘤第三位。近年來(lái)，盡管各種檢測(cè)方法、手術(shù)方案有了較大進(jìn)步，放化療手段不斷更新，靶向治療等新方法涌現(xiàn)，但結(jié)直腸癌的5年生存率仍?xún)H在50%左右。因此，探討影響結(jié)直腸癌預(yù)后的相關(guān)因素，尋找預(yù)測(cè)預(yù)后的生物標(biāo)志，有助于改善結(jié)直腸癌患者的治療效果。TNM分期是目前臨床判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的重要依據(jù)，但腫瘤的異質(zhì)性導(dǎo)致相同TNM分期患者在腫瘤預(yù)后或治療反應(yīng)出現(xiàn)不一致性。近年研究發(fā)現(xiàn)，癌基因多態(tài)性在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，并影響結(jié)直腸癌患者的預(yù)后，可能成為結(jié)直腸癌的預(yù)后指標(biāo)之一[3]。

GSTM1是Ⅱ相代謝酶GST家族成員之一，參與外源化合物的代謝解毒過(guò)程。GSTM1基因純合缺失(空白基因型)的個(gè)體無(wú)相應(yīng)的蛋白酶活性，不能對(duì)相應(yīng)的致癌物質(zhì)進(jìn)行有效的代謝，導(dǎo)致有害物質(zhì)損傷細(xì)胞和遺傳物質(zhì)，從而增加個(gè)體腫瘤遺傳易感性。目前，已經(jīng)證實(shí)GSTM1與肺癌[4]、肝癌[5]、胃癌[6]等多種惡性腫瘤易感性相關(guān)，GSTM1與結(jié)直腸癌易感性的關(guān)系也備受關(guān)注。有關(guān)GSTM1基因多態(tài)性與惡性腫瘤生存率的關(guān)系國(guó)內(nèi)外亦有報(bào)告，其中GSTM1空白基因型與乳腺癌[7]、前列腺癌[8]、食管癌[9]、慢性粒細(xì)胞白血病[10]等惡性腫瘤的較低生存率有關(guān)系，但有關(guān)GSTM1基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的預(yù)后關(guān)系研究尚少，結(jié)果也存在爭(zhēng)議。Stoehlmacher等[11]的研究結(jié)果表明，GSTM1基因多態(tài)性與直腸癌患者生存期無(wú)明顯相關(guān)性。 Kap等[12]對(duì)755例接受奧沙利鉑化療的結(jié)直腸癌患者生存分析后發(fā)現(xiàn)，與GSTM1非缺失基因型相比，GSTM1缺失基因型者具有較高的死亡風(fēng)險(xiǎn)度(HR=2.25，95%CI：0.93，5.44)。為了探討GSTM1基因缺失與結(jié)直腸癌生存期的關(guān)系，我們對(duì)86例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行隨訪，結(jié)果顯示，GSTM1基因非缺失者中位生存期81.92個(gè)月，而GSTM1基因缺失者的生存期更短，其中位生存期為64.61個(gè)月。而Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析結(jié)果顯示，GSTM1基因缺失是結(jié)直腸癌患者死亡的獨(dú)立預(yù)后因素(P<0.05)，GSTM1基因缺失結(jié)直腸癌患者的死亡相對(duì)危險(xiǎn)度是GSTM1基因無(wú)缺失者的2.37倍(95%CI：1.30，4.54)，這與Kap等[11]的研究結(jié)果相似。除了GSTM1基因缺失外，研究對(duì)象的TNM分期及腫瘤分化程度都可影響生存期的長(zhǎng)短，且TNM分期IV期、腫瘤分化程度低的結(jié)直腸癌患者的中位生存期也相對(duì)縮短。進(jìn)一步多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析結(jié)果也顯示，TNM分期、腫瘤分化程度均是結(jié)直腸癌患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，這提示TNM分期IV期、腫瘤分化程度低的結(jié)直腸癌患者的預(yù)后差。但本研究鑒于樣本量較小，以及結(jié)直腸癌的預(yù)后還可能受到其他基因多態(tài)性的影響，今后我們應(yīng)該加大樣本量，并選擇多種相關(guān)基因多態(tài)性作進(jìn)一步前瞻性研究，以期為將來(lái)結(jié)直腸癌的治療及預(yù)后判斷提供更準(zhǔn)確的證據(jù)。

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Association of glutathione S-transferase M1 null genotype with prognosis in patients with colorectal cancer

ZENGLi-ping1,WUHe-ping1,WUShi-hui1,YANGMei-lan2,LIANGLu2

(1DepartmentofPathology,BasicMedicineCollege,HunanUniversityofMedicine,Huaihua418000,China;2DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofHunanUniversityofMedicine,Huaihua418000,China)

Objective To investigate the association of glutathione S-transferase M1(GSTM1) null genotype with prognosis in patients with colorectal cancer.Methods GSTM1 gene of peripheral blood was detected in 86 patients with colorectal cancer by PCR before surgery.Kaplan-Meier method was used to calculate the median survival time in the patients with different GSTM1 gene types or different clinicopathological features.The factors influencing the death of patients with colorectal cancer was analyzed using multivariate Cox regression.Results Eight-six cases included 32 of GSTM1(+) and 54 of GSTM1(+).The median survival time of patients with GSTM1 null genotype was 64.61 months,and was shorter than that of patients with GSTM1(81.92 months,P<0.05).GSTM1 null genotype(RR=2.37),TNM stage(RR=1.86) and tumor differentiation(RR=1.58) were the independent risk factors for the death of patients with colorectal cancer(P<0.05).Conclusion The colorectal cancer patients with GSTM1 null genotype have shorter survival times and higher risk for death.TNM stage and tumor differentiation are also the risk factors for the death of patients with colorectal cancer.

Colorectal cancer,Glutathione S-transferase M1,Survival time,Death

湖南省教育廳科研基金資助項(xiàng)目(12C1193)；湖南醫(yī)藥學(xué)院校級(jí)科研基金資助項(xiàng)目(2012KY04)

曾麗平(1984～)，女，碩士，講師，研究方向：消化道腫瘤。

R 735.37

A

0253-4304(2016)07-0932-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.07.11

2016-03-07

2016-05-18)