徐傳國(guó)

(天津市濱海新區(qū)塘沽中心血站，天津 300456)

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·綜 述·

血液病毒核酸檢測(cè)技術(shù)在我國(guó)的應(yīng)用現(xiàn)狀

徐傳國(guó)

(天津市濱海新區(qū)塘沽中心血站，天津 300456)

核酸檢測(cè)技術(shù)(NAT)是直接檢測(cè)病原體核酸的一系列技術(shù)的總稱，是一種靈敏度、特異性高和檢測(cè)通量大的血液病毒檢測(cè)方法，可明顯縮短血液病毒檢測(cè)窗口期并能檢測(cè)出因病毒變異而漏檢的血液，顯著提高輸血安全。本文對(duì)血液病毒核酸檢測(cè)技術(shù)在我國(guó)的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，以期為我國(guó)血站開展血液病毒核酸檢測(cè)在方法選擇、檢測(cè)系統(tǒng)選擇、實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)和管理、檢測(cè)模式等方面提供參考。

血液病毒；核酸檢測(cè)技術(shù)(NAT)；應(yīng)用現(xiàn)狀

輸血安全最大的威脅是輸血傳播疾病的發(fā)生。常規(guī)檢測(cè)方法(酶聯(lián)免疫)存在窗口期過長(zhǎng)和病毒變異等現(xiàn)象[1]，有較大漏檢的風(fēng)險(xiǎn)，給輸血安全帶來(lái)巨大威脅。近些年在天津、甘肅、成都、杭州等血液中心陸續(xù)出現(xiàn)5例人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus， HIV)陽(yáng)性窗口期漏檢情況。核酸檢測(cè)技術(shù)(nucleic acid detection technology， NAT)在國(guó)內(nèi)臨床中的應(yīng)用已有近20年，積累了豐富的實(shí)驗(yàn)室和質(zhì)控管理經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)近些年來(lái)政府對(duì)采供血機(jī)構(gòu)的支持投入不斷加大，血站系統(tǒng)軟硬件設(shè)施均有明顯提升，使得在國(guó)內(nèi)血站推廣應(yīng)用血篩NAT檢測(cè)成為可行方法。當(dāng)前輸供血形勢(shì)比較嚴(yán)峻，采用靈敏度高、窗口期短的血液NAT檢測(cè)技術(shù)迫在眉睫?，F(xiàn)對(duì)血液核酸檢測(cè)技術(shù)在我國(guó)的應(yīng)用現(xiàn)狀綜述如下。

1 NAT應(yīng)用概況

NAT主要原理是將病毒核酸直接擴(kuò)增或其附帶的信號(hào)放大后，轉(zhuǎn)變成直觀的光電或可視信號(hào)，繼而判斷相應(yīng)的病原體是否存在于標(biāo)本中，檢測(cè)步驟包括核酸的提取、擴(kuò)增和檢測(cè)。方法主要有PCR擴(kuò)增和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的TMA擴(kuò)增。PCR是在體外模擬自然DNA半保留復(fù)制過程的NAT技術(shù)，具有靈敏度和特異性高等特點(diǎn)；TaqDNA聚合酶(TaqDNA polymerase)的使用實(shí)現(xiàn)了PCR技術(shù)自動(dòng)化檢測(cè)。TMA可以DNA或RNA為模板，在約42 ℃等溫反應(yīng)條件下利用RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物為RNA。TMA操作簡(jiǎn)便，擴(kuò)增效率高，適于高通量檢測(cè)[2-4]。1997年荷蘭和德國(guó)最早將NAT應(yīng)用于血液篩查，日本是全世界首個(gè)將核酸檢測(cè)應(yīng)用于常規(guī)血液篩查的國(guó)家，1999年新加坡、美國(guó)等國(guó)也陸續(xù)開展，英法兩國(guó)則從2000年開始進(jìn)行NAT檢測(cè)[5]。在中國(guó)，2000年初廈門、山東、上海、深圳等地相繼開展了血液病毒核酸檢測(cè)，取得了一定的成效；2010年和2012年在多家血液中心(血站)開展了血液核酸檢測(cè)試點(diǎn)工作，在核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)和質(zhì)量管理、人員培訓(xùn)、血液篩查模式等方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，顯著降低了輸血傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)，為在全國(guó)范圍開展血液病毒核酸檢測(cè)奠定了良好的基礎(chǔ)。

2 我國(guó)應(yīng)用的NAT檢測(cè)系統(tǒng)

目前已經(jīng)國(guó)家藥監(jiān)局(SFDA)批準(zhǔn)、可應(yīng)用于血液病毒NAT檢測(cè)的系統(tǒng)有下列幾種[5]。

2.1 美國(guó)諾華公司的Tigris檢測(cè)系統(tǒng) Tigris檢測(cè)設(shè)備配套Procleix Ultrio Assay檢測(cè)試劑，能夠檢測(cè)HBV、HCV、HIV-1，采用TMA化學(xué)發(fā)光技術(shù)，為單人份樣本檢測(cè)模式，能夠鑒別出病毒種類。Tigris是集標(biāo)本加樣、核酸提取、擴(kuò)增、檢測(cè)于一體的全自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，擴(kuò)增效率高，操作簡(jiǎn)便，適于高通量檢測(cè)。

2.2 美國(guó)羅氏公司的s201檢測(cè)系統(tǒng) 由加樣、提取、擴(kuò)增檢測(cè)設(shè)備配套cobas TaqScreen MPX檢測(cè)試劑，采用熒光PCR擴(kuò)增技術(shù)，為6人份的樣本混合檢測(cè)模式，如有反應(yīng)性需進(jìn)一步進(jìn)行單人份拆分檢測(cè)，能夠檢測(cè)HBV、HCV、HIV-(1+2)，并能區(qū)分出病毒種類。

2.3 中山達(dá)安、上海科華、上海浩源血源篩查系統(tǒng) 3家均為國(guó)內(nèi)公司，都研發(fā)生產(chǎn)出了國(guó)產(chǎn)NAT檢測(cè)試劑盒，能夠檢測(cè)HBV、HCV、HIV-1，配套檢測(cè)設(shè)備均為進(jìn)口設(shè)備，在自動(dòng)混樣儀上進(jìn)行混樣、加樣、核酸提取，使用熒光PCR儀進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè)，3家采用的均是熒光定量PCR法，為8人份的樣本混合檢測(cè)模式，如有反應(yīng)性需進(jìn)一步進(jìn)行單人份拆分檢測(cè)，能區(qū)分出病毒種類。

可見目前國(guó)內(nèi)血站核酸檢測(cè)模式主要有3個(gè)：?jiǎn)螜z、6混樣、8混樣。在進(jìn)行血液NAT檢測(cè)時(shí)，NAT對(duì)每份樣本檢測(cè)的靈敏度至關(guān)重要，樣本數(shù)不能混合過多，樣本數(shù)混合越少檢出率越高，檢測(cè)單人份樣本最為理想，不然低病毒含量的血液易被漏檢。此外各檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)原理和試劑檢測(cè)的靈敏度也不盡相同，對(duì)每種病毒的檢出能力也有所不同，各血站須依據(jù)本地區(qū)的流行病學(xué)特點(diǎn)以及國(guó)內(nèi)外試劑的檢測(cè)性能、各種檢測(cè)模式對(duì)病毒的檢出能力等并結(jié)合成本-效益分析，選擇適用于本地區(qū)的血液核酸檢測(cè)系統(tǒng)。

3 血液病毒核酸檢測(cè)的規(guī)范化管理

我國(guó)血站技術(shù)操作規(guī)程(2015版)從多方面對(duì)血液病毒核酸檢測(cè)進(jìn)行了規(guī)范性要求，有效地保證了血液病毒核酸檢測(cè)質(zhì)量。

3.1 NAT檢測(cè)試劑、儀器設(shè)備和信息系統(tǒng)的管理要求 必須選擇經(jīng)SFDA批準(zhǔn)的血源篩查試劑，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立試劑的評(píng)價(jià)選擇和確認(rèn)、證照審核程序，建立并執(zhí)行進(jìn)貨查驗(yàn)制度、質(zhì)檢制度，將說(shuō)明書列入文件受控范圍，做好試劑的儲(chǔ)存和質(zhì)量監(jiān)控。新的或經(jīng)過維修后對(duì)檢測(cè)結(jié)果可能造成影響的設(shè)備在投入使用前須經(jīng)過確認(rèn)，系統(tǒng)在投入使用前須進(jìn)行分析靈敏度驗(yàn)證，依據(jù)設(shè)備說(shuō)明書進(jìn)行操作。對(duì)整個(gè)檢測(cè)過程須使用實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)進(jìn)行管理，應(yīng)設(shè)置系統(tǒng)運(yùn)行參數(shù)的權(quán)限控制。

3.2 NAT實(shí)驗(yàn)室防污染控制 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)設(shè)置試劑耗材儲(chǔ)存區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)，各區(qū)不允許直接相通。對(duì)空氣流向?qū)嵤┛刂?，擴(kuò)增產(chǎn)物不得進(jìn)入擴(kuò)增前的區(qū)域。實(shí)驗(yàn)室須配有清潔、消毒設(shè)施，在試驗(yàn)完成后進(jìn)行清潔和消毒。

3.3 NAT檢測(cè)標(biāo)本和試驗(yàn)操作的管理 標(biāo)本的質(zhì)量、可追溯性應(yīng)符合要求。制定標(biāo)本采集與送檢程序，使用無(wú)菌、無(wú)DNA和RNA酶含惰性分離膠的真空采血管。依據(jù)試劑生產(chǎn)商提供的試劑使用說(shuō)明書進(jìn)行操作，設(shè)置自動(dòng)化設(shè)備運(yùn)行參數(shù)的權(quán)限控制。

3.4 試驗(yàn)性能監(jiān)控和試驗(yàn)結(jié)果的判定 須對(duì)檢測(cè)過程的試驗(yàn)性能進(jìn)行持續(xù)監(jiān)控，使用質(zhì)控品的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，監(jiān)控檢測(cè)系統(tǒng)的有效性和穩(wěn)定性。須參加實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)，以評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)的能力。對(duì)每批試驗(yàn)關(guān)鍵控制點(diǎn)進(jìn)行核查，制定試驗(yàn)有效性和標(biāo)本試驗(yàn)結(jié)果的判定規(guī)則。

4 血液NAT檢測(cè)在我國(guó)的應(yīng)用效果

采用對(duì)ELISA檢測(cè)HBsAg、抗-HCV、HIV抗原抗體結(jié)果陰性的獻(xiàn)血者血液進(jìn)行NAT混樣檢測(cè)模式，其陽(yáng)性檢出率西安為0.07%[6]、廈門為0.13%[7]、上海為0.1%[8]、常州為0.1%[9]。采用對(duì)獻(xiàn)血者平行進(jìn)行ELISA和NAT單檢檢測(cè)模式，其陽(yáng)性檢出率南京為0.06%[10]、青島為0.1%[11]。陽(yáng)性檢出率的不同可能與區(qū)域人群分布差異以及HBV感染率的差異有關(guān)(NAT陽(yáng)性中HBV占絕大多數(shù))。國(guó)內(nèi)亦有地區(qū)NAT檢測(cè)出HIV、HCV的報(bào)道[7]?？梢?，對(duì)獻(xiàn)血者血液進(jìn)行NAT檢測(cè)可以及時(shí)檢出“窗口期”血液，有效降低輸血傳播HBV、HCV 和HIV的風(fēng)險(xiǎn)。由于ELISA 檢測(cè)方法對(duì)部分“窗口期”標(biāo)本存在較多的漏檢，以及NAT方法對(duì)“窗口期”、隱匿性感染標(biāo)本在檢測(cè)方面的優(yōu)勢(shì)，在ELISA檢測(cè)HBV、HCV 和HIV方法的基礎(chǔ)之上，聯(lián)合對(duì)獻(xiàn)血者的血標(biāo)本進(jìn)行NAT檢測(cè)，能進(jìn)一步防止“窗口期”、隱匿性感染血液進(jìn)入輸血流程，從而減少HBV、HCV 和HIV 通過輸血傳播的可能性，進(jìn)一步提高輸血安全。

5 結(jié)束語(yǔ)

我國(guó)已將NAT血液篩查納入《全血及成分血質(zhì)量要求》[12]中，并且國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委下發(fā)了《關(guān)于做好血站核酸檢測(cè)工作的通知》，要求各地確保2015年全部開展血液病毒核酸檢測(cè)。目前不論從技術(shù)、人員資質(zhì)以及質(zhì)量管理水平等方面，我國(guó)均具備了全面開展血液病毒核酸檢測(cè)的條件，而主要的制約因素為檢測(cè)經(jīng)費(fèi)的落實(shí)。相信隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平的不斷提升，逐步摸索建立適合我國(guó)國(guó)情的血液病毒篩查模式，既能減少經(jīng)濟(jì)的投入，又能最大限度地降低輸血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)，從而保證輸血安全。

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R446.11

A

10.11851/j.issn.1673-1557.2016.06.001

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1688.R.20161109.1559.014.html

2016-03-23)

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