張　露，蔣夢(mèng)彤 綜述，陳　罡，李　佳審校（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，廣西南寧530021）

自噬在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展*

張露，蔣夢(mèng)彤 綜述，陳罡，李佳△審校
（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，廣西南寧530021）

自噬；腫瘤；溶酶體；細(xì)胞器；綜述

自噬（autophagy）是真核細(xì)胞內(nèi)的一種降解途徑，能通過(guò)溶酶體使細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)等成分降解，廣泛存在于人體的正常細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞中。自噬與惡性腫瘤的關(guān)系是近年生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，多數(shù)研究采用不同的方法探討二者的關(guān)系，而研究結(jié)論偏向于自噬在惡性腫瘤中起著促進(jìn)與抑制的雙重作用，但針對(duì)這些研究方法的文獻(xiàn)綜述較少。本文針對(duì)自噬在惡性腫瘤中常用的研究方法及其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行綜述，以期為惡性腫瘤研究工作中自噬研究方法的選擇及結(jié)果解釋提供幫助。

1　自噬與惡性腫瘤

自噬的概念最先由比利時(shí)科學(xué)家Christian de Duve提出，它是真核細(xì)胞內(nèi)的一種降解途徑，能通過(guò)溶酶體使細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)等成分降解。自噬性降解是機(jī)體內(nèi)的一種病理生理過(guò)程，這一過(guò)程主要包括隔離膜（isolation membrane）或吞噬泡（phagophore）的形成及延伸、自噬體（autophagosome）的形成、自噬體和溶酶體融合形成自噬溶酶體（autolysosome），最終胞內(nèi)物質(zhì)降解，產(chǎn)生的降解產(chǎn)物如氨基酸、脂肪酸等可被細(xì)胞再利用。自噬現(xiàn)象的出現(xiàn)是以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞器的更新為目的，對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種有利的修復(fù)與防御機(jī)制。Meijer等［1］的研究表明，哺乳動(dòng)物細(xì)胞有著基礎(chǔ)的自噬來(lái)降解并回收損傷的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)，同時(shí)，自噬降解后的產(chǎn)物可為細(xì)胞提供生存所必需的能量。而Gozuacik等［2］的研究提出了一些惡性腫瘤的發(fā)生伴隨有自噬水平的抑制。自噬與惡性腫瘤的關(guān)系吸引了眾多研究人員的關(guān)注，成為國(guó)際學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)。大量研究發(fā)現(xiàn)，自噬與惡性腫瘤的耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)［3］，而自噬相對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展來(lái)說(shuō)是一把“雙刃劍”［4］，既可起到促進(jìn)的作用又可表現(xiàn)出抑制的效果。作者認(rèn)為這除了與自噬本身的復(fù)雜性和其作用于惡性腫瘤的方式、途徑及分子機(jī)制不盡相同相關(guān)外，還與研究自噬所采用的方法相關(guān)。

2　自噬的人工干預(yù)和調(diào)節(jié)

正常情況下培養(yǎng)的細(xì)胞自噬活性很低，而一些惡性腫瘤的自噬水平又是受抑制的［2］。這不利于自噬現(xiàn)象的觀察，對(duì)自噬進(jìn)行人工干預(yù)和調(diào)節(jié)就顯得很有必要。研究中常用工具藥實(shí)現(xiàn)，有時(shí)根據(jù)研究目的，使用到一些遺傳學(xué)技術(shù)，可以在基因的分子水平上對(duì)自噬進(jìn)行干預(yù)。

2.1工具藥自噬的工具藥可分為與自噬相關(guān)的抑制劑和誘導(dǎo)劑2種。常用的自噬抑制劑有3-甲基腺嘌呤（3-MA）［5］、巴弗洛霉素A1［6］及氯喹［7］，而常用的自噬誘導(dǎo)劑有西羅莫司、氯化鋰［8］及構(gòu)造營(yíng)養(yǎng)缺乏的環(huán)境［9］。工具藥可以根據(jù)不同的原理干預(yù)和調(diào)節(jié)自噬，例如，3-MA可抑制ClassⅢ磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信號(hào)通路來(lái)抑制自噬體的形成，以此阻斷自噬發(fā)生的步驟，而西羅莫司可抑制mTOR通路，以此誘導(dǎo)自噬活性增強(qiáng)。因此，工具藥的選擇應(yīng)根據(jù)研究目的而定。

2.2遺傳學(xué)技術(shù)自噬的遺傳學(xué)技術(shù)包括RNA干擾（RNAi）技術(shù)與近年發(fā)展起來(lái)的CRISPR-Cas9技術(shù)［10］（最新出現(xiàn)的一種由RNA指導(dǎo)的Cas9核酸酶對(duì)靶向基因進(jìn)行編輯的技術(shù)）。RNAi是指利用與靶基因序列同源的雙鏈RNA（dsRNA）可誘導(dǎo)特異性基因沉默的一種現(xiàn)象，因此RNAi技術(shù)可用于沉默或直接敲除目標(biāo)基因的表達(dá)，同時(shí)具有較高特異性的特點(diǎn)，該技術(shù)目前普遍用于基因分子水平上的研究。通過(guò)RNAi技術(shù)沉默惡性腫瘤中與自噬相關(guān)的基因，觀察自噬活性的變化，從而得出自噬與惡性腫瘤間的聯(lián)系，可以為惡性腫瘤的靶向治療提供新思路［11］。CRISPR-Cas9技術(shù)被稱(chēng)為接近目標(biāo)基因組編輯的最終工具包，因其在基因組編輯中所體現(xiàn)出的超高的效率和簡(jiǎn)易的技術(shù)而吸引著眾多科研工作者，同時(shí)被認(rèn)為是在體細(xì)胞基因分子水平治療上的一個(gè)新機(jī)遇［12］。Kim等［13］通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)成功敲除自噬相關(guān)基因ATG5［14］，用以研究敲除ATG5后的黑色素瘤細(xì)胞中自噬抵抗BH3模擬棉酚所起的保護(hù)作用。CRISPR-Cas9技術(shù)開(kāi)啟了自噬與惡性腫瘤關(guān)系研究方法上的新篇章，而對(duì)于通過(guò)自噬相關(guān)分子及基因治療惡性腫瘤，更是提供了無(wú)限的可能與巨大的探索空間。綜上，遺傳學(xué)技術(shù)相比工具藥特異性更強(qiáng)，二者相互結(jié)合，可以更好地使研究者根據(jù)研究目的對(duì)自噬進(jìn)行人工干預(yù)和調(diào)節(jié)。

3　自噬的檢測(cè)方法

自噬在體內(nèi)是一個(gè)隨時(shí)間不斷變化的過(guò)程，自噬發(fā)生的步驟猶如一條“流水線”，先是隔離膜或吞噬泡的集結(jié)和延伸，接著自噬體形成，形成的自噬體與溶酶體融合，最后自噬性底物降解，產(chǎn)物就會(huì)被輸送至細(xì)胞質(zhì)中為細(xì)胞提供能量。為了保證細(xì)胞快速適應(yīng)惡劣環(huán)境的變化，這一“流水線”的過(guò)程就會(huì)非?？欤棺允涩F(xiàn)象的檢測(cè)比較困難。目前，自噬的檢測(cè)方法主要基于這條“流水線”中的某一“時(shí)空點(diǎn)”或者某一“時(shí)空段”，相對(duì)自噬這一動(dòng)態(tài)過(guò)程，這些檢測(cè)方法本質(zhì)上均是靜態(tài)的。

3.1基于“時(shí)空點(diǎn)”的檢測(cè)該類(lèi)檢測(cè)常用的有透射電子顯微鏡、LC3免疫印跡及LC3單熒光檢測(cè)，這些均基于自噬體的直接或間接檢測(cè)原理。

3.1.1透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡主要通過(guò)觀察自噬性結(jié)構(gòu)［15］的形成及數(shù)量來(lái)判斷自噬的發(fā)生，所觀察的自噬性結(jié)構(gòu)中最主要的是自噬體，因此是自噬體的直接檢測(cè)方法［16］。透射電子顯微鏡檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性基于觀察者對(duì)自噬體在鏡下結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確判斷，這就不可避免地存在一定的主觀性，同時(shí)，樣本的制備也可影響觀察者的判斷。例如，脂質(zhì)雙分子層受制備過(guò)程所用試劑的影響而發(fā)生改變，影響對(duì)自噬體膜的判斷，也可因不同切面自噬體數(shù)量不一而在推算整個(gè)細(xì)胞的自噬情況時(shí)結(jié)果出現(xiàn)誤差。由此可見(jiàn)，透射電子顯微鏡探索自噬現(xiàn)象是基于形態(tài)學(xué)的觀察，同樣存在著不足的地方，使用時(shí)應(yīng)結(jié)合其他檢測(cè)來(lái)相互驗(yàn)證。

3.1.2LC3免疫印跡LC3為自噬體膜上多功能標(biāo)記蛋白［17］。自噬形成時(shí)，彌漫于細(xì)胞質(zhì)中的LC3（即LC3-Ⅰ）與磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）偶聯(lián)，轉(zhuǎn)變成LC3-Ⅱ附著于自噬體膜上，當(dāng)自噬體向溶酶體呈遞后方才降解消失。因此，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)LC3-Ⅱ的表達(dá)或測(cè)定LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值可以從一定程度反映自噬體數(shù)量的多少［18］，這種檢測(cè)即是基于自噬體間接的檢測(cè)原理。這一方法的缺陷在于LC3抗體對(duì)LC3蛋白的2種類(lèi)型親和力不相同，對(duì)LC3-Ⅱ有更高的親和力，因此會(huì)出現(xiàn)較高的假陽(yáng)性率。

3.1.3綠色熒光蛋白（GFP）-LC3單熒光檢測(cè)該方法的檢測(cè)原理也是基于LC3在自噬形成過(guò)程中與PE偶聯(lián)并錨定于自噬體膜上的現(xiàn)象，利用GFP與LC3融合，根據(jù)熒光顯微鏡下綠色熒光斑點(diǎn)來(lái)示蹤自噬形成［19］。自噬沒(méi)有發(fā)生時(shí)，GFP-LC3融合蛋白彌漫分布于細(xì)胞質(zhì)中，而當(dāng)自噬發(fā)生之后，GFP-LC3融合蛋白就會(huì)集結(jié)且錨定在自噬體膜上，此時(shí)使用熒光顯微鏡即可觀察到相對(duì)明顯的綠色熒光斑點(diǎn)，而這些斑點(diǎn)代表的就是自噬體，再通過(guò)計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)，就可以估測(cè)自噬體的數(shù)量。

3.2基于“時(shí)空段”的檢測(cè)該種檢測(cè)有別于“時(shí)空點(diǎn)”檢測(cè)。“時(shí)空點(diǎn)”檢測(cè)得出的結(jié)果大多解釋為自噬體數(shù)量的多少，而這可能由于自噬某一通路受阻使得自噬體數(shù)量多少與自噬活性強(qiáng)弱不相符［20］?！皶r(shí)空段”的檢測(cè)包含了自噬形成的多個(gè)步驟及自噬降解過(guò)程的檢測(cè)，因此可檢測(cè)到自噬流（autophagic flux）［21］，這使得在形態(tài)學(xué)檢測(cè)基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行功能學(xué)檢測(cè)成為可能，可在一定程度上得知自噬活性的強(qiáng)弱，但仍舊無(wú)法實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)自噬現(xiàn)象所發(fā)生的全部過(guò)程?！皶r(shí)空段”常見(jiàn)的檢測(cè)方法有紅色熒光蛋白（RFP）-GFP-LC3雙熒光檢測(cè)、LC3動(dòng)態(tài)檢測(cè)、長(zhǎng)壽命蛋白降解檢測(cè)。

3.2.1RFP-GFP-LC3雙熒光檢測(cè)在GFP-LC3單熒光指示體系的基礎(chǔ)上，增加RFP，利用GFP在酸性環(huán)境下其綠色熒光會(huì)發(fā)生淬滅而RFP對(duì)酸性環(huán)境不敏感及其紅色熒光不會(huì)發(fā)生淬滅的原理進(jìn)行自噬活性的檢測(cè)［22］。結(jié)果判讀時(shí)，通過(guò)顯微鏡成像后紅綠熒光融合，融合后出現(xiàn)的黃色斑點(diǎn)即是自噬體，紅色斑點(diǎn)是自噬溶酶體。因此，可通過(guò)計(jì)數(shù)不同顏色的斑點(diǎn)來(lái)反映自噬流的強(qiáng)弱。這種檢測(cè)方法的缺點(diǎn)在于不能反映出自噬降解的過(guò)程，同時(shí)，溶酶體酶的活力及其pH值也可影響信號(hào)的檢測(cè)。

3.2.2LC3動(dòng)態(tài)檢測(cè)從自噬體形成、自噬體向溶酶體呈遞，到自噬性底物降解，這些步驟的發(fā)生均伴隨著LC3量的不斷變化。通過(guò)LC3動(dòng)態(tài)檢測(cè)，即可將這個(gè)變化的過(guò)程反映出來(lái)，從而反映自噬活性的強(qiáng)弱。LC3動(dòng)態(tài)檢測(cè)所采用的技術(shù)手段有免疫印跡，也可通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，也有研究通過(guò)加入一種溶酶體抑制劑來(lái)比較LC3-Ⅱ前后的差別，得出加入溶酶體抑制劑后LC3-Ⅱ表達(dá)增多的那部分，代表的即是被溶酶體所要降解的自噬體［23］。

3.2.3長(zhǎng)壽命蛋白降解檢測(cè)哺乳動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的降解可通過(guò)蛋白酶體ATP依賴(lài)的泛素降解和溶酶體ATP非依賴(lài)降解2種途徑，蛋白酶體主要負(fù)責(zé)降解短壽命蛋白，而長(zhǎng)壽命蛋白則主要通過(guò)溶酶體途徑降解。根據(jù)溶酶體降解長(zhǎng)壽命蛋白并在自噬誘導(dǎo)后與自噬體相融合的特性，將同位素標(biāo)記法應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞合成的蛋白就會(huì)被同位素標(biāo)記，而后把細(xì)胞轉(zhuǎn)移至不含同位素的普通細(xì)胞培養(yǎng)基，使被標(biāo)記的短壽命蛋白優(yōu)先降解，隨后開(kāi)始自噬誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后自噬活性增強(qiáng)，長(zhǎng)壽命蛋白隨之降解，此時(shí)測(cè)定上清液的放射活度，即反映出細(xì)胞經(jīng)由自噬來(lái)降解底物的能力［24］。

4　自噬在體內(nèi)的研究方法

自噬在體內(nèi)的研究方法已有先例，Mizushima［25］已成功構(gòu)建GFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠，使得體內(nèi)實(shí)時(shí)監(jiān)控自噬成為可能。但目前有關(guān)自噬在體內(nèi)的研究方法的文獻(xiàn)不多，因此，使用GFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行體內(nèi)自噬研究時(shí)，要結(jié)合體外自噬的檢測(cè)方法，以避免單一方法的局限性。

5　小結(jié)與展望

本文簡(jiǎn)單概述了自噬與惡性腫瘤的研究現(xiàn)狀并列舉了自噬的人工干預(yù)和調(diào)節(jié)方法、自噬的檢測(cè)方法及自噬在體內(nèi)的研究方法，這些方法普遍應(yīng)用于惡性腫瘤中自噬現(xiàn)象的研究。遺憾的是，目前還沒(méi)有一種方法可以準(zhǔn)確可靠而特異地檢測(cè)自噬，因此，自噬在惡性腫瘤中表現(xiàn)出的抑制與促進(jìn)的雙重作用也可能與自噬的研究方法使用不當(dāng)相關(guān)。為了避免研究方法引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋上的錯(cuò)誤，就需要研究者理性地評(píng)估每一個(gè)研究結(jié)論。同時(shí)，自噬研究方法上的不足也為有志研究這一領(lǐng)域的科研工作者提供了巨大的探索空間，自噬與惡性腫瘤關(guān)系的研究也有望為惡性腫瘤的臨床治療提供新靶點(diǎn)。

［1］Meijer AJ，Codogno P.Regulation and role of autophagy in mammalian cells［J］.Int J Biochem Cell Biol，2004，36（12）：2445-2462.

［2］Gozuacik D，Kimchi A.Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism［J］.Oncogene，2004，23（16）：2891-2906.

［3］Ojha R，Bhattacharyya S，Singh SK.Autophagy in cancer stem cells：a potential link between chemoresistance，recurrence，and metastasis［J］.Biores Open Access，2015，4（1）：97-108.

［4］Zhou Y，Rucker EB 3rd，Zhou BP.Autophagy regulation in the development and treatment of breast cancer［J］.Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2016，48（1）：60-74.

［5］Li J，Yang D，Wang W，et al.Inhibition of autophagy by 3-MA enhances IL-24-induced apoptosis in human oral squamous cell carcinoma cells［J］. J Exp Clin Cancer Res，2015，34：97.

［6］ Klionsky DJ，Elazar Z，Seglen PO，et al.Does bafilomycin A1 block the fusion of autophagosomes with lysosomes？［J］.Autophagy，2008，4（7）：849-850.

［7］Lv X，Liu F，Shang Y，et al.Honokiol exhibits enhanced antitumor effects with chloroquine by inducing cell death and inhibiting autophagy in human non-small cell lung cancer cells［J］.Oncol Rep，2015，34（3）：1289-1300.

［8］Sarkar S，Krishna G，Imarisio S，et al.A rational mechanism for combination treatment of Huntington′s disease using lithium and rapamycin［J］. Hum Mol Genet，2008，17（2）：170-178.

［9］Moreau K，Ghislat G，Hochfeld W，et al.Transcriptional regulation of An-nexin A2 promotes starvation-induced autophagy［J］.Nat Commun，2015，6：8045.

［10］Quétier F.The CRISPR-Cas9 technology：closer to the ultimate toolkit for targeted genome editing［J］.Plant Sci，2016，242：65-76.

［11］Ye L，Zhao X，Lu J，et al.Knockdown of TIGAR by RNA interference induces apoptosis and autophagy in HepG2 hepatocellular carcinoma cells［J］. Biochem Biophys Res Commun，2013，437（2）：300-306.

［12］Jordan B.CRISPR-Cas9，a new chance for somatic gene therapy［J］.Med Sci（Paris），2015，31（11）：1035-1038.

［13］Kim NY，Han BI，Lee M.Cytoprotective role of autophagy against BH3 mimetic gossypol in ATG5 knockout cells generated by CRISPR-Cas9 endonuclease［J］.Cancer Lett，2015，370（1）：19-26.

［14］Khan IA，Lu JP，Liu XH，et al.Multifunction of utophagy-related genes a in filamentous fungi［J］.Microbiol Res，2012，167（6）：339-345.

［15］Eskelinen EL.Fine structure of the autophagosome［J］.Methods Mol Biol，2008，445：11-28.

［16］Yl?-Anttila P，Vihinen H，Jokitalo E，et al.Monitoring autophagy by electron microscopy in Mammalian cells［J］.Methods Enzymol，2009，452：143-164.

［17］Hu YF，Lei X，Zhang HY，et al.Expressions and clinical significance of autophagy-related markers Beclin1，LC3，and EGFR in human cervical squamous cell carcinoma［J］.Onco Targets Ther，2015，8：2243-2249.

［18］Kimura S，F(xiàn)ujita N，Noda T，et al.Monitoring autophagy in mammalian cultured cells through the dynamics of LC3［J］.Methods Enzymol，2009，452：1-12.

［19］Kim I，Lemasters JJ.Mitochondrial degradation by autophagy（mitophagy）in GFP-LC3 transgenic hepatocytes during nutrient deprivation［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2011，300（2）：308-317.

［20］馬泰，孫國(guó)平，李家斌.細(xì)胞自噬的研究方法［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2012，39（3）：204-209.

［21］Klionsky DJ，Abdalla FC，Abeliovich H，et al.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy［J］.Autophagy，2012，8（4）：445-544.

［22］Wang W，Zhang Q，Zhao R，et al.Establishment of RAW264.7 cell strain stably expressing RFP-GFP-LC3］［J］.Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2015，31（9）：1175-1178.

［23］Tanida I，Minematsu-Ikeguchi N，Ueno T，et al.Lysosomal turnover，but not a cellular level，of endogenous LC3 isamarker for autophagy［J］.Autophagy，2005，1（2）：84-91.

［24］Klionsky DJ，AM Cuervo，Seglen PO.Methods for monitoring autophagy from yeast to human［J］.Autophagy，2007，3（3）：181-206.

［25］Mizushima N.Methods for monitoring autophagy using GFP-LC3 transgenic mice［J］.Methods Enzymol，2009，452：13-23.

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.07.020

A

1009-5519（2016）07-1018-04

廣西壯族自治區(qū)自然科學(xué)基金青年基金（2015GXNSFBA139158）。

△，E-mail：jialee2005@126.com。

（2015-12-19）