高秀麗，黨燕娜，翟曉紅，胡建宏

(1.白水縣畜牧獸醫(yī)局，陜西 白水 715600；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院)

豬精液冷凍保護(hù)劑的研究進(jìn)展

高秀麗1，黨燕娜2，翟曉紅2，胡建宏2

(1.白水縣畜牧獸醫(yī)局，陜西 白水 715600；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院)

摘要：冷凍保護(hù)劑是豬精液冷凍稀釋液的關(guān)鍵組分，能有效緩解冷凍及復(fù)蘇過程中對(duì)精子造成的損傷，是決定豬精液冷凍效果的重要因素。因此，研究新型冷凍保護(hù)劑，是提高豬精液冷凍保存效果的有力措施。本文就近年來國內(nèi)外抗氧化性物質(zhì)、糖類等新型冷凍保護(hù)劑的研究與應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期進(jìn)一步提高豬冷凍精液的質(zhì)量，發(fā)揮良種的種用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：冷凍保護(hù)劑；豬精液；研究進(jìn)展

冷凍保護(hù)劑是豬精液冷凍稀釋液的關(guān)鍵組分，能有效緩解冷凍及復(fù)蘇過程中對(duì)精子造成的損傷，是決定豬精液冷凍效果的重要因素，研發(fā)新型冷凍保護(hù)劑是提高豬精液冷凍保存效果的有力措施。傳統(tǒng)的冷凍保護(hù)劑為卵黃、牛奶、甘油、乙二醇、二甲基亞砜(DMSO)等。隨著研究的不斷深入，抗氧化性物質(zhì)、糖類等也作為冷凍保護(hù)劑添加應(yīng)用并取得了一定的效果。本文就近年來國內(nèi)外抗氧化性物質(zhì)、糖類等新型冷凍保護(hù)劑的研究與應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步提高豬精液冷凍效果奠定基礎(chǔ)。

1抗氧化性物質(zhì)

豬的精子更易遭到有氧代謝過程產(chǎn)生的活性氧類(ROS)攻擊而發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而致使大量的精子膜損傷，例如細(xì)胞膜的選擇通透性降低，細(xì)胞內(nèi)酶發(fā)生泄漏，精子的呼吸等生命活動(dòng)受到抑制等，因而豬精子對(duì)超低溫冷凍比較敏感?；诖耍梢酝茰y(cè)在冷凍稀釋劑中添加抗氧化性物質(zhì)可起到保護(hù)精子的作用，并且近年來的研究證明，保護(hù)液中添加抗氧化性物質(zhì)可提高豬精液冷凍保存效果。李芳等研究了四種抗氧化劑對(duì)豬精液冷凍保存效果的影響，表明單獨(dú)或復(fù)合添加6 mg/mL的維生素C和0.8 mg/mL的生物類黃酮均可提高豬精液冷凍效果；添加4%的多不飽和脂肪酸(PUFA)或添加0.6 mg/ml的維生素E均能顯著提高豬精子冷凍-解凍后的質(zhì)量；聯(lián)合添加4%的PUFA和0.6 mg/ml維生素E時(shí)，豬精液冷凍效果明顯優(yōu)于單因子組。

α-硫辛酸是一種功能多、活性強(qiáng)的抗氧化劑。胡曉辰等研究表明，單獨(dú)添加6.0 mg/L的α-硫辛酸能提高凍后精子的頂體完整率、精子活率、線粒體活性和質(zhì)膜完整率等各項(xiàng)指標(biāo)，且聯(lián)合添加4.0 mg/L的α-硫辛酸和600 mg/L維生素C效果優(yōu)于單獨(dú)添加α-硫辛酸；單獨(dú)添20 mg/L的β-胡蘿卜素和600 mg/L的維生素E均能顯著提高冷凍精液品質(zhì)，二者聯(lián)合添加效果更佳，且最佳配伍濃度為20 mg/L的β-胡蘿卜素和400 mg/L維生素E。淫羊藿多糖具有較強(qiáng)的免疫活性和抗氧化活性，對(duì)羥基自由基體系和超氧陰離子自由基體系均有不同程度的清除作用。李軍偉等研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍稀釋液中添加4 mg/mL的淫羊藿多糖可以提高豬精液的凍后品質(zhì)。

諸多研究結(jié)果均證明了抗氧化性物質(zhì)在精液冷凍保存過程中發(fā)揮的積極作用，且大多數(shù)抗氧化物質(zhì)之間存在互作。因此，兩種或兩種以上抗氧化劑的合理搭配添加，是冷凍保護(hù)劑的研究重點(diǎn)之一。

2糖類

在精子的冷凍保護(hù)劑中，甘油是一種常用的滲透性冷凍保護(hù)劑，可以在冷凍過程中滲透進(jìn)入精細(xì)胞膜，降低細(xì)胞內(nèi)水分含量，從而緩解冰晶化對(duì)精子造成的損傷但精子作為活細(xì)胞，對(duì)甘油具有一定的耐受范圍，高濃度的甘油會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生毒害作用。Zeng等研究發(fā)現(xiàn)，僅2%～3%的甘油適于豬精子的冷凍保存，隨著甘油濃度增加，可能促使精子的凋亡。糖類可通過保護(hù)精子質(zhì)膜而發(fā)揮作用，糖類的羥基可以與精子膜磷脂的磷酸根結(jié)合，從而置換周圍的水分子，防止冷凍時(shí)冰晶化對(duì)精子的危害。除此之外，多糖無法進(jìn)入精子胞質(zhì)膜內(nèi)，可提高細(xì)胞外滲透壓，使細(xì)胞內(nèi)的水分在冷凍過程中向細(xì)胞外滲出，引起細(xì)胞脫水皺縮，進(jìn)一步減少細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，從而保護(hù)精子免受破壞。因此，某些多糖可部分代替甘油，緩解甘油對(duì)精子的毒害作用，提高冷凍精液的品質(zhì)。

李青旺等發(fā)現(xiàn)，紅景天多糖和絞股藍(lán)多糖能提高豬精子的凍后活率，枸杞多糖對(duì)豬精子活率沒有影響。三種多糖在高濃度添加時(shí)均能提高精子的凍后質(zhì)膜完整率；紅景天多糖可保護(hù)豬精子凍后頂體完整性和頂體獲能樣變化；絞股藍(lán)多糖和無保護(hù)作用，這可能與紅景天的生長(zhǎng)環(huán)境和多糖組成成分有關(guān)。

劉穎等研究表明，糖類與甘油互作能夠有效提高豬精子凍后品質(zhì)，添加0.06 mg/ml的茯苓多糖可以有效降低甘油的添加量，但不能完全替代甘油用作抗凍保護(hù)劑來使用；當(dāng)濃度為 2.4%的甘油與0.06mg/mL的茯苓多糖聯(lián)合使用時(shí)效果較好。潘紅梅等研究了不同雙糖組合對(duì)豬精子冷凍保存效果的影響，將不同雙糖以不同比例組合添加于豬精液冷凍保護(hù)液后，以33.3%的乳糖和66.7%的蔗糖的組合對(duì)豬精液冷凍保存的效果最好。

3其他物質(zhì)

禽類卵黃常被用作冷凍保護(hù)劑，卵黃作為禽類卵細(xì)胞的主要營養(yǎng)部分，含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，其各個(gè)組分在冷凍過程中發(fā)揮的作用有所差異。Lamia等研究表明，禽類卵黃中的高密度脂蛋白在冷凍過程中會(huì)對(duì)精子造成一定的損傷，而LDL可參與降低冷凍對(duì)精子的傷害過程；用LDL完全替代蛋黃后，不僅可以維持冷凍后的精子頂體完整率、質(zhì)膜完整性和體外受精后囊胚發(fā)育率，而且可顯著提高凍后精子的活力及體外受精后的卵裂率。因此，用LDL替代卵黃可得到更好的保存效果。呂瑞凱等提取了雞、鴨、鵪鶉、鴿子和鴕鳥等5種不同禽類的卵黃LDL，比對(duì)分析不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)、不同來源的LDL對(duì)豬精子冷凍保存效果的影響，研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%的鴿蛋卵黃LDL對(duì)凍后精子活率、頂體完整性和質(zhì)膜完整性均有顯著優(yōu)化作用，為L(zhǎng)DL在豬精液冷凍保存中的應(yīng)用提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。

豬精液冷凍技術(shù)克服了精液長(zhǎng)期保存和長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)膯栴}，使精液使用不受時(shí)間和地域的限制，不僅降低了種群維持、引種等成本，更為保護(hù)豬種質(zhì)資源、建立針對(duì)人類健康與疾病的遺傳改良動(dòng)物模型基因庫等提供了新的方法與思路，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物領(lǐng)域，用動(dòng)物細(xì)胞(冷凍精子)替動(dòng)物整體(種公豬)，也是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)核心內(nèi)容“3R”原則：替代(replacement)、減少 (reduction)、優(yōu)化(refinement)的重要內(nèi)容之一。隨著對(duì)豬精子冷凍機(jī)理的深入研究，新的冷凍保存劑不斷被發(fā)現(xiàn)，除了上述抗氧化性物質(zhì)、糖類、LDL之外，中藥提取物的添加也取得了較好的效果，勢(shì)必會(huì)研發(fā)出更有效、更安全的新型冷凍保存稀釋液，使豬精液冷凍技術(shù)技術(shù)日臻完善和成熟，并在實(shí)踐中得到廣泛的推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn):

[1]Alireza F,Willem JH,Cheng FP et al. Acrosome-intact boar spermatozoa initiate binding to the homologous zona pellucida in vitro [J]. Biology of Reproduction, 1997,56: 430-438.

[2]李芳.四種抗氧化劑對(duì)豬精液冷凍保存效果的影響[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)院碩士學(xué)位論文，2012.

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[7]潘紅梅，張亮，藍(lán)靜，等.不同雙糖組合對(duì)豬精子冷凍保存效果的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31(2)：35-39.

Research Progress on Boar Semen Cryoprotectants

GAO Xiu-li1,DANG Yan-na2,ZHAI Xiao-hong2,HU jian-hong2

(1.LivestockandveterinarybureauofBaishui,BaishuiShaanxi715600,China;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity)

Abstract:As an important additive of cryopreservation dilution,cryoprotectants can remit the damage to the sperm caused by freezing and recovery . Cryoprotectants is the key factor influencing the effectiveness of freezing semen,and therefore,researching new cryoprotectants is a good measure to maximize the impact of freezing semen. The research advancement of new cryoprotectants such as antioxidant and saccharides are reviewed in this paper.

Key words:cryoprotectant;boar semen;research progress

[收稿日期]2015-10-18

[基金項(xiàng)目]國家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-36)；楊凌示范區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014NY-22)；西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)示范站(基地)科技成果推廣項(xiàng)目(TGZX2015-18)。

[作者簡(jiǎn)介]高秀麗(1977-)，女，陜西白水人，大專，助理畜牧師，主要從事畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣工作。

[中圖分類號(hào)]S 814.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1004-6704(2016)02-0062-02