龔　淼，張　雷，趙　昱，尹　青，郭淺妤，任廣偉(.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，河北 石家莊 05007；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 05003)

?

·論著·

小鼠生精細(xì)胞的體外雙室無(wú)血清培養(yǎng)

龔淼1，張雷1，趙昱1，尹青1，郭淺妤1，任廣偉2*(1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 050031)

[摘要]目的探討無(wú)血清條件下應(yīng)用插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿(Transwell小室)對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞-支持細(xì)胞-生精細(xì)胞的雙室培養(yǎng)技術(shù)。方法取60日齡C57BL/6雄性小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞和15日齡雄性小鼠睪丸支持細(xì)胞與生精細(xì)胞混合細(xì)胞團(tuán)雙室共培養(yǎng),不添加血清。每日在倒置顯微鏡下觀察生精細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)情況，蘇木精染色觀察生精細(xì)胞形態(tài)，染色體倍性分析檢測(cè)細(xì)胞分化情況。結(jié)果在培養(yǎng)1周后,可見圓形精子細(xì)胞出現(xiàn)，2周后可見長(zhǎng)形精子細(xì)胞,3周后可見較短鞭毛，生精細(xì)胞可存活8周；培養(yǎng)1周時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)可檢測(cè)出單倍體細(xì)胞，單倍體細(xì)胞百分比隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加。結(jié)論應(yīng)用雙室無(wú)血清培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)小鼠生精細(xì)胞可獲得精子且生精細(xì)胞存活時(shí)間較長(zhǎng)。

[關(guān)鍵詞]精細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；小鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.01.001

由于精子發(fā)生與睪丸結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，很難針對(duì)整個(gè)有機(jī)體精子發(fā)生及相關(guān)基因的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。同時(shí)，外源化學(xué)物質(zhì)對(duì)精子發(fā)生的影響逐漸引起更多學(xué)者的關(guān)注，主要以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外研究為主[1-2]。因此，生精細(xì)胞的體外培養(yǎng)成為深入研究精子發(fā)生過(guò)程,闡明精子發(fā)生相關(guān)基因功能與作用機(jī)制的手段[3-4]。長(zhǎng)期且穩(wěn)定的體外培養(yǎng)生精細(xì)胞成為基因功能研究、靶向基因治療和藥物研發(fā)新模型的基礎(chǔ)條件[5]。目前，生精細(xì)胞的培養(yǎng)方法主要有單細(xì)胞培養(yǎng)、支持細(xì)胞-生精細(xì)胞共培養(yǎng)和睪丸組織塊培養(yǎng)三類，培養(yǎng)時(shí)間較短，細(xì)胞存活率低，不能獲得令人滿意的單倍體精子細(xì)胞轉(zhuǎn)化率[6]。本研究在不添加外源血清的條件下應(yīng)用Transwell小室對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞-支持細(xì)胞-生精細(xì)胞進(jìn)行雙室培養(yǎng)，模擬生精細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)微環(huán)境，以期建立一個(gè)長(zhǎng)期穩(wěn)定的小鼠生精細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，旨在為小鼠生精細(xì)胞的體外分化研究提供細(xì)胞模型。

1材料與方法

1.1動(dòng)物與主要試劑15日齡和60日齡清潔級(jí)C57BL/6雄性小鼠(合格證號(hào)：SCXK京2009-0004)，購(gòu)買于北京華阜康生物科技股份有限公司。DMEM-F12培養(yǎng)液購(gòu)自Hyelone公司，胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒酸鈉(insulin-transferrin-selenium，ITS)、脫氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonuclease Ⅰ，DNaseⅠ)、膠原酶Ⅰ、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)、睪酮、視黃酸、重組人促卵泡激素(recombination-follicle stimulating hormone,rFSH)購(gòu)自Sigma公司。

1.2睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離、純化與培養(yǎng)無(wú)菌取出60日齡小鼠雙側(cè)睪丸，眼科剪剪碎后用0.03%膠原酶37 ℃水浴振蕩消化15 min(150 r/min)，取上清液離心后再次加入0.03%膠原酶，勻速振蕩15 min(130 r/min)，取上清液離心重懸后第3次加入0.03%膠原酶，慢速消化15 min(100 r/min)，吸取上清液離心，重懸后應(yīng)用配制好的55%Percoll 連續(xù)密度梯度離心液，室溫離心 15 min(3 000 r/min)，收集37%~60%的細(xì)胞用間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液(100 mL DMEM/F-12培養(yǎng)液中，含有10 000 U青霉素、100 mg鏈霉素、100 μL ITS)制成細(xì)胞懸液，經(jīng)3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)染色鑒定后接種于6孔板的各孔內(nèi)。

1.3睪丸支持細(xì)胞-生精細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 無(wú)菌取出15~18日齡小鼠睪丸，輕柔快速去除睪丸周圍脂肪組織與附睪，用含青霉素、鏈霉素和兩性霉素的D-Hank's緩沖液沖洗。冰上去除睪丸被膜，用眼科剪剪碎游離的生精小管，于上述緩沖液中孵育 2 min，加入0.1%膠原酶Ⅳ，37 ℃水浴振蕩30 min(80 r/min)，離心棄上清，重復(fù)使用用0.1%膠原酶Ⅳ消化5 min(80 r/min)，取沉淀物加入0.25%胰蛋白酶和0.1%透明質(zhì)酸酶，混勻后37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置5 min，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，棄去上清液，加入含0.1% 膠原酶Ⅳ、0.1%透明質(zhì)酸酶和1.0 μg/mL DNaseⅠ的 DMEM-F12培養(yǎng)液，37 ℃水浴振蕩 5 min(80 r/min)，室溫靜置5 min，應(yīng)用共培養(yǎng)體系培養(yǎng)液(100 mL DMEM-F12培養(yǎng)液中，含有10 000 U青霉素、100 mg鏈霉素、100 μg EGF、100 μL ITS、0.5 μmol/L視黃酸、0.1 μmol/L睪酮、2.5 U rFSH重懸細(xì)胞)。

1.4睪丸間質(zhì)細(xì)胞-支持細(xì)胞-生精細(xì)胞雙室培養(yǎng)體系的建立將6孔培養(yǎng)板的6個(gè)孔內(nèi)接種間質(zhì)細(xì)胞，支持細(xì)胞-生精細(xì)胞團(tuán)接種到Transwell小室內(nèi)，小室內(nèi)加入上述共培養(yǎng)體系培養(yǎng)液，6孔板孔內(nèi)加入間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液，使小室外液面略高于小室底部。隔日進(jìn)行不完全換液，每次換掉2/3舊液。

1.5蘇木精染色 取Transwell小室內(nèi)懸浮的生精細(xì)胞團(tuán)，用4%多聚甲醛固定 12 h后離心，常規(guī)石蠟包埋細(xì)胞團(tuán)塊，切片機(jī)連續(xù)切4 μm厚蠟帶制成石蠟切片，常規(guī)HE與蘇木精染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)生精細(xì)胞中單倍體細(xì)胞比例分別于培養(yǎng)第1、7、14、21、28和42天取生精細(xì)胞加入70%乙醇，-20 ℃固定12 h，洗滌后加入碘化丙碇(propidium iodide，PI)染液，室溫靜置15 min后上機(jī)檢測(cè)PI熒光強(qiáng)度，四倍體(4N)細(xì)胞表示初級(jí)精母細(xì)胞，二倍體(2N)細(xì)胞表示精原細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞，單倍體(1N)細(xì)胞表示精子細(xì)胞。每次計(jì)數(shù)104個(gè)細(xì)胞，計(jì)算單倍體細(xì)胞百分比。

2結(jié)果

2.1倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)第2天，Transwell小室底部薄膜上的支持細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)；以精原細(xì)胞和精母細(xì)胞為主的生精細(xì)胞團(tuán)懸浮生長(zhǎng)于支持細(xì)胞上。培養(yǎng)第1周，生精細(xì)胞團(tuán)內(nèi)可見體積較大的細(xì)胞為精母細(xì)胞和體積較小的圓形精子細(xì)胞(圖1A)。培養(yǎng)第2周，生精細(xì)胞成團(tuán)附著于支持細(xì)胞表層，但未見貼壁；生精細(xì)胞團(tuán)中出現(xiàn)處于形態(tài)改變過(guò)程中的長(zhǎng)形精子細(xì)胞(圖1B)。培養(yǎng)第3周，游離于培養(yǎng)液中的圓形細(xì)胞數(shù)量增多；可見正在分裂的細(xì)胞，細(xì)胞飽滿，折光性較強(qiáng)；偶見胞體呈橢圓形改變的精子細(xì)胞一端出現(xiàn)鞭毛(圖1C)。

2.2蘇木精染色觀察培養(yǎng)第1周，生精細(xì)胞團(tuán)中初級(jí)精母細(xì)胞數(shù)量增多，精原細(xì)胞體較小,呈圓形或橢圓形,胞核呈卵圓形,染色質(zhì)粗細(xì)不一，胞質(zhì)染色淺；初級(jí)精母細(xì)胞體積較大，呈圓形，細(xì)胞核大而圓，呈絨球狀；可見少量圓形精子細(xì)胞，體積小，核呈圓形，染色質(zhì)細(xì)密，核質(zhì)比大(圖2A)。培養(yǎng)第2周，可見處于形態(tài)改變過(guò)程中的精子細(xì)胞，由圓形變?yōu)殚L(zhǎng)形，細(xì)胞核偏向一側(cè)，染色加深(圖2B)。培養(yǎng)第3周，可見一端長(zhǎng)出鞭毛的精子細(xì)胞，細(xì)胞核深染，呈錐體形，胞質(zhì)未完全脫落(圖2C)。

圖1倒置相差顯微鏡下雙室培養(yǎng)生精細(xì)胞的形態(tài)(×400)

A.第7天;B.第15天;C.第21天

Figure 1Changes in the microscopic aspect of cocultured Leydig cell-sertoli cell-spermatogenic cells in bicameral chambers(×400)

圖2雙室培養(yǎng)生精細(xì)胞的形態(tài)(蘇木精染色 ×1 000)

A.第7天; B.第15天; C.第21天

Figure 2Morphological structure of spermatogenic cells (Hematoxylin staining×1 000)

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單倍體細(xì)胞百分比培養(yǎng)第7天開始出現(xiàn)少量單倍體細(xì)胞，占細(xì)胞總數(shù)的(15.32±1.02)%，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，單倍體細(xì)胞的百分比逐漸增高至(24.93±1.65)%。

3討論

精子正常發(fā)生的微環(huán)境主要取決于2個(gè)因素：一是睪丸支持細(xì)胞，參與精子發(fā)生的啟動(dòng)與維持，分泌多種蛋白類物質(zhì)維持生精上皮微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，對(duì)生精細(xì)胞起支持、營(yíng)養(yǎng)與保護(hù)作用[7]；二是睪丸間質(zhì)細(xì)胞，是體內(nèi)睪酮的主要分泌細(xì)胞，雄激素在精子發(fā)生過(guò)程中不可或缺[8]。同時(shí)，間質(zhì)細(xì)胞與支持細(xì)胞之間存在相互影響、相互作用的關(guān)系。支持細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子，直接或間接地作用于間質(zhì)細(xì)胞，在二者之間形成短環(huán)式結(jié)構(gòu)，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞更好地發(fā)揮作用[9]。間質(zhì)細(xì)胞通過(guò)分泌雄激素等相關(guān)物質(zhì)促進(jìn)支持細(xì)胞的功能發(fā)揮。本研究采用間質(zhì)細(xì)胞-支持細(xì)胞-生精細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，借鑒國(guó)內(nèi)外關(guān)于間質(zhì)細(xì)胞原代分離的方法[10-12]。首先，采用低濃度膠原酶差速消化與Percoll密度梯度離心法相結(jié)合，有效去除睪丸結(jié)締組織和其他細(xì)胞，差速消化用時(shí)短，減輕了消化酶對(duì)間質(zhì)細(xì)胞的損傷，提高了間質(zhì)細(xì)胞的獲得率和純度；3β-HSD只存在于睪丸間質(zhì)細(xì)胞的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，應(yīng)用此酶鑒定間質(zhì)細(xì)胞純度，使結(jié)果準(zhǔn)確可靠[13]。其次，采用改良方法分離純化支持細(xì)胞與生精細(xì)胞，膠原酶去除生精小管周圍的結(jié)締組織，能較好地分離生精小管，胰蛋白酶與透明質(zhì)酸酶可有效去除生精小管周圍的肌樣上皮細(xì)胞和基膜等；為避免酶類對(duì)細(xì)胞的損傷，本研究應(yīng)用多種酶聯(lián)合短時(shí)消化，保證了細(xì)胞的純度和完整性。同時(shí)，本研究首次采用間質(zhì)細(xì)胞-支持細(xì)胞-生精細(xì)胞雙室共培養(yǎng)，在培養(yǎng)皿內(nèi)放置一個(gè)底部由透明的滲透性薄膜構(gòu)成的套皿，使培養(yǎng)皿分隔為上下兩室，間質(zhì)細(xì)胞在下室的間質(zhì)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，支持細(xì)胞與生精細(xì)胞置于上室，間質(zhì)細(xì)胞分泌的雄激素和細(xì)胞因子通過(guò)滲透膜進(jìn)入上室的共培養(yǎng)體系培養(yǎng)液中，使共培養(yǎng)體系的生理環(huán)境接近生精細(xì)胞在睪丸中發(fā)育的微環(huán)境，促進(jìn)生精細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性，使生精細(xì)胞存活時(shí)間超過(guò)30 d，初級(jí)精母細(xì)胞完成精子發(fā)生的過(guò)程，產(chǎn)生了形態(tài)學(xué)上的精子，但由于數(shù)量很少，沒有進(jìn)行活力檢測(cè)，后續(xù)研究將分離精子進(jìn)行體外受精實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)精子是否具有功能。

本研究選取15日齡小鼠睪丸組織，使分離的生精細(xì)胞團(tuán)內(nèi)只有支持細(xì)胞、精原細(xì)胞和少量初級(jí)精母細(xì)胞，與非阻塞性無(wú)精子癥患者睪丸組織內(nèi)細(xì)胞成分相似。有研究顯示，生精細(xì)胞發(fā)育障礙與睪丸內(nèi)支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的功能異常及局部微環(huán)境失衡有關(guān)[14-15]。本研究在模擬睪丸組織內(nèi)微環(huán)境的條件下，體外培養(yǎng)生精細(xì)胞，脫離了患者睪丸組織內(nèi)不良環(huán)境，在體外將初級(jí)精母細(xì)胞誘導(dǎo)分化為單倍體精子細(xì)胞甚至形成長(zhǎng)尾的精子。同時(shí)，本研究不在培養(yǎng)體系中加入動(dòng)物源性的血清，為以后人的精子細(xì)胞培養(yǎng)與移植的研究提供了無(wú)外源動(dòng)物因子干擾的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

由于Transwell小室空間有限，支持細(xì)胞在鋪滿小室底部后發(fā)生接觸抑制，存活時(shí)間大約可維持1個(gè)半月左右，同時(shí)，睪丸支持細(xì)胞分泌雄激素的功能也在3周后逐漸降低。本研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)4周后生精細(xì)胞存活率明顯降低，8周后存活細(xì)胞已很少。提示生精細(xì)胞存活率降低有可能與支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的功能降低有關(guān)。本研究重新分離純化睪丸支持細(xì)胞接種于Transwell小室底部薄膜上，將培養(yǎng)8周后存活的生精細(xì)胞移至支持細(xì)胞表面，培養(yǎng)2周后生精細(xì)胞仍有少量存活，但未見精子細(xì)胞出現(xiàn)鞭毛，這可能與生精細(xì)胞生存環(huán)境的改變有直接關(guān)系。

本研究流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)第7天開始出現(xiàn)少量單倍體細(xì)胞，提示圓形精子細(xì)胞出現(xiàn)于培養(yǎng)第7天左右，與形態(tài)學(xué)研究結(jié)果一致。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，精子細(xì)胞的數(shù)量逐漸增加，提示生精細(xì)胞發(fā)生了分化，形成了精子細(xì)胞。

綜上所述，在生精細(xì)胞-支持細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞雙室共培養(yǎng)體系中，不外源添加動(dòng)物血清，也能獲得長(zhǎng)形精子細(xì)胞甚至精子，并能延長(zhǎng)生精細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間，為生精細(xì)胞的培養(yǎng)與分化提供新的技術(shù)方法。此外，生精細(xì)胞體外與間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞雙室共培養(yǎng)，不僅模擬了睪丸組織內(nèi)各種細(xì)胞的正常功能，還避免了體內(nèi)不良內(nèi)分泌環(huán)境的干擾，在維持睪丸內(nèi)各細(xì)胞間聯(lián)系的基礎(chǔ)上，真實(shí)地反映精子發(fā)生過(guò)程中各類生精細(xì)胞的發(fā)育情況，不僅可用于研究外源化學(xué)物質(zhì)對(duì)精子發(fā)生的影響，也有利于闡明精子發(fā)生的調(diào)控機(jī)制。本研究計(jì)劃后續(xù)實(shí)驗(yàn)嘗試使用該培養(yǎng)體系獲得的單倍體精子進(jìn)行卵胞漿內(nèi)單精子注射，深入檢測(cè)培養(yǎng)體系能否培養(yǎng)具有受精能力的正常精子，進(jìn)一步完善培養(yǎng)體系。

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(本文編輯：趙麗潔)

Establishment of culture system of mouse spermatogenic cells in vitro without serum

GONG Miao1,ZHANG Lei1,ZHAO Yu1,YIN Qing1,GUO Qian-yu1,REN Guang-wei2*

(1.Department of Histology and Embryology,the School of Basic Medical Science,Hebei Medical

University,Shijiazhuang 050017,China;2.Department of Nephrology,the First Hospital of

Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a mouse Leydig cell-Sertoli cell-germ cell double-chamber coculture system in vitro without serum.MethodsThe Leydig cells were isolated from the testes of postnatal day 60 male C57BL/6 mice.Total germ cells and Sertoli cells were isolated from the testes of postnatal day 15 male C57BL/6 mice.The cells in bicameral chambers culture system were grown in media without serum.The morphology and growth of culture cells were monitored daily under contrast phase microscope,and were identified by Hematoxylin staining.Ploidy analysis of cells was observed by flow cytometry.ResultsIn bicameral culture system,sporadic round spermatids were detected after one week,and elongating spermatids or spermatids with flagella were observed after three weeks.The spermatogenic cells survived as long as eight weeks.The haploid peak was detected after one week; the percentage of monoploid increased with culture time.ConclusionThe spermatogenic cells in bicameral culture system matured into morphologically normal spermatozoa and survived longer.

[Key words]spermatids；cell culture techniques；mice

[中圖分類號(hào)]R321.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1007-3205(2016)01-0001-04

*通訊作者

[作者簡(jiǎn)介]龔淼(1983-)，女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事組織胚胎學(xué)研究。

[基金項(xiàng)目]河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(H2013201139)

[收稿日期]2015-09-14；[修回日期]2015-10-26