● 李麗麗 朱紅梅

柴郁地仙方對圍絕經(jīng)期抑郁癥模型大鼠行為學及HPG軸的影響※

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目的：探討柴郁地仙方抗圍絕經(jīng)期抑郁癥的作用途徑。方法：50只SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組、鹽酸氟西汀組、戊酸雌二醇組、柴郁地仙方組，每組10只，假手術(shù)組行假手術(shù)，其余行卵巢去勢術(shù)后孤養(yǎng)并予以21d慢性輕度不可預見性刺激，觀察刺激過程大鼠行為學變化，采用Elisa法檢測血清E2、FSH、LH水平。結(jié)果：柴郁地仙方能夠維持大鼠Open-Field水平得分穩(wěn)定，上調(diào)血清E2水平，抑制血清FSH、LH過度分泌，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。結(jié)論：柴郁地仙方能改善圍絕經(jīng)期抑郁癥大鼠行為，其機制可能與糾正HPG軸功能紊亂相關(guān)。

柴郁地仙方 圍絕經(jīng)期抑郁癥 HPG軸

圍絕經(jīng)期抑郁癥(PDD)是指初發(fā)于圍絕經(jīng)期，以持續(xù)的情緒抑郁為主要特征的一種情感障礙性疾病[1]?？挂钟襞c激素替代療法對本病的治療具有一定的效果，但由于PDD本身發(fā)病的復雜性及藥物潛在的副作用，患者依存性較差[2-3]。中醫(yī)學主張整體觀念與辨證論治相結(jié)合，對疾病的治療有多靶點、毒副作用小、依從性好的優(yōu)點。中藥復方柴郁地仙方在治療PDD的臨床應(yīng)用中療效顯著[4]，但藥理機制尚不明確。本實驗觀察柴郁地仙方對PDD模型大鼠行為學及下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸的影響。

1 材料

1.1 藥物 柴郁地仙方：柴胡12g，郁金10g，熟地黃10g，仙靈脾10g，黨參10g，茯苓10g，法半夏12g(免煎沖劑，江陰天江藥業(yè)有限公司)；鹽酸氟西汀膠囊(上海中西制藥有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：150102)；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司生產(chǎn)，進口藥注冊號：H20120368，藥品批準文號：國藥準字J20130009)。

1.2 動物 SPF級SD大鼠50只，3～4月齡，體重(240±10)g，購自廈門大學實驗動物中心[許可證號：SCXK(閩)2013-0001]。5只/籠飼養(yǎng)，食物與水充足供給，可自由攝取，飼養(yǎng)室溫度(22±1)℃，相對濕度50%，光照時間7：00-19：00，適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境1周后開始實驗。

1.3 主要試劑 大鼠雌二醇(E2)、促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成激素(LH)酶聯(lián)免疫吸附測定(Elisa)試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司，批次號分別為：20150725B、20150810B、20150725B)。

1.4 主要儀器 ZH-ZFT型曠場實驗視頻分析系統(tǒng)(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；M2000多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)，CKX31倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，CHOL-16M高速臺式冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組 50只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、鹽酸氟西汀組、戊酸雌二醇組、柴郁地仙方組，每組10只大鼠，其中假手術(shù)組大鼠行假手術(shù)，其余4組大鼠均進行卵巢去勢手術(shù)。

2.2 卵巢去勢手術(shù)(Ovx)[5]大鼠經(jīng)7%水合氯醛溶液(400ml/kg)腹腔注射麻醉后腹位固定，于最末肋骨下端、腋中線距脊柱外2cm處切開皮膚、筋膜及肌肉層，取出黃色脂肪包裹的黃紅相間的卵巢組織，分離脂肪團，將卵巢、輸卵管及周圍脂肪一并結(jié)扎切除，將子宮放回原位，縫合肌肉和皮膚，用青霉素鈉敷于傷口處。

2.3 假手術(shù)(SHAM)[6]取出大鼠黃色脂肪包裹的黃紅相間的卵巢組織，確保卵巢及輸卵管組織完整，僅切除卵巢周圍部分脂肪團，將卵巢送回腹腔，逐層縫合，同法摘除對側(cè)卵巢周圍脂肪團，其它步驟與Ovx組相同。

2.4 大鼠動情周期觀察 將蘸有生理鹽水的棉拭子輕輕插入大鼠陰道內(nèi)約1～2cm，輕輕旋轉(zhuǎn)擦拭后取出，將棉拭子擦拭下的陰道分泌物均勻涂抹到載玻片上，于倒置電子顯微鏡下觀察標本中半透明陰道上皮細胞數(shù)量，每日18：00進行，連續(xù)6d。陰道上皮細胞數(shù)量沒有明顯變化，說明手術(shù)清除卵巢成功；反之失敗。假手術(shù)組大鼠涂片中上皮細胞數(shù)量應(yīng)存在周期性變化。

2.5 抑郁模型制備[7]采用孤養(yǎng)與21d慢性輕度不可預見性應(yīng)激(CUMS)相結(jié)合的方法建立抑郁模型。刺激包括：冰水游泳(4℃，5min)、熱應(yīng)激(45℃，5min)、夾尾(1min)、禁水(24h)、禁食(48h)、潮濕墊料(24h)、束縛(1h)、鼠籠傾斜(45°，24h)、晝夜顛倒、通宵照明，平均每種刺激2次，按順序進行2輪。假手術(shù)組5只/籠常規(guī)飼養(yǎng)，不參與CUMS過程。

2.6 藥物干預 假手術(shù)組、模型組予生理鹽水灌胃，鹽酸氟西汀組予鹽酸氟西汀混懸液灌胃，戊酸雌二醇組予戊酸雌二醇混懸液灌胃，柴郁地仙方組予柴郁地仙方混懸液灌胃。藥物按大鼠-人體質(zhì)量等效劑量比6.3配制，4℃保存，0.1mL·kg-1體重灌胃，灌胃前加熱至37℃，自CUMS開始第1d起至結(jié)束后1d，共22d，每日18：00進行。

2.7 行為學觀察(Open-field實驗) 于CUMS第1d、11d和21d早晨8：00-12：00昏暗安靜環(huán)境下進行。實驗曠場邊長100×100cm，周壁高30cm，周壁及底部為黑色。觀察者通過懸掛于敞箱之上的攝像頭于計算機上觀察動物情況并記錄其5min內(nèi)水平移動距離。每只大鼠僅進行1次測試。

2.8 標本取材 CUMS刺激21d后空腹飼養(yǎng)24h后，10%水合氯醛溶液，0.3mL/100g腹腔注射麻醉，下腹處剪除長毛后常規(guī)消毒，切開皮膚和腹肌，進行腹主動脈抽血，4℃低溫儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.9 血清E2、FSH、LH水平測定 血液標本4℃環(huán)境3000r/min離心15min，取上清液按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

3 結(jié)果

3.1 對Open-Field水平移動總距離的影響 CUMS刺激前各組大鼠水平移動總距離得分間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。CUMS后第1d開始給藥干預，21d刺激結(jié)束后，停止藥物干預。結(jié)果顯示模型組水平得分顯著下降(P<0.01)，造模成功。柴郁地仙方組與模型組比較，CUMS第11d及21d水平得分均顯著提高(均P<0.01)。三種藥物均能提高模型大鼠水平移動得分，然而，短期(CUMS第11d)、長期(CUMS第21d)效果存在差異：短期干預水平得分柴郁地仙方組顯著高于兩陽性藥物組(均P<0.05)；長期干預水平得分柴郁地仙方組與鹽酸氟西汀組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，顯著高于戊酸雌二醇組(P<0.01)。見表1。

表1 Open-Field水平移動總距離得分

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與柴郁地仙方組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 對血清性激素水平的影響 Ovx手術(shù)合21d孤養(yǎng)與CUMS刺激配合藥物干預后，模型大鼠血清E2水平顯著下降(P<0.01)，F(xiàn)SH、LH水平顯著升高(均P<0.01)。柴郁地仙方能夠逆轉(zhuǎn)這一變化，升高E2水平，降低LH、FSH水平，與模型組比較差異顯著(均P<0.01)。柴郁地仙方對血清激素作用與戊酸雌二醇差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。柴郁地仙方與鹽酸氟西汀對模型大鼠血清E2水平影響差異無統(tǒng)計學意義，柴郁地仙方組血清FSH、LH水平顯著低于鹽酸氟西汀組(均P<0.05)。見表2。

表2 對血清性激素水平的影響(n=10)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與柴郁地仙方組比較，#P<0.05。

4 討論

本實驗以O(shè)vx方法建立一種內(nèi)源性雌激素撤退的模型，以探究外源藥物干預對激素水平的影響。該方法基本模擬了圍絕經(jīng)期女性卵巢功能衰退的生理狀態(tài)，被廣泛應(yīng)用于圍絕經(jīng)期動物研究和激素研究中[8]。慢性抑郁狀態(tài)模型的建立采用孤養(yǎng)與CUMS相結(jié)合的方法，具有應(yīng)激因子多變性和不可預測性的特點，能夠反映人類抑郁發(fā)生、發(fā)展機制[9]。假手術(shù)組大鼠保留卵巢功能，經(jīng)動態(tài)陰道涂片觀察后證明符合育齡期大鼠生理狀態(tài)。模型組與藥物干預組均行Ovx術(shù)及21d孤養(yǎng)與CUMS，動態(tài)陰道涂片觀察已證明無內(nèi)源性激素波動對實驗結(jié)果造成影響，實驗結(jié)果能夠較為客觀的評價藥物干預對性腺軸的作用。

《素問·陰陽應(yīng)象大論》云：“年四十而陰氣自半?！薄夺t(yī)學正傳》認為：“月經(jīng)全憑腎水施化，腎水既乏，則經(jīng)血日以干涸?！眹^經(jīng)期是一個緩慢的過渡階段，自身存在腎精衰少的生理特征，目前中醫(yī)界對于本病的治療也主要以腎精不足為出發(fā)點，提倡補腎疏肝的治療原則[10]。然而，抑郁發(fā)作與狂躁發(fā)作相對立，核心癥狀表現(xiàn)為情緒低落、興趣缺乏、樂趣喪失[11]，基于陰陽對立統(tǒng)一的理論，本課題組認為PDD的發(fā)生一定原因是由于陽氣的不足引起的。在選方過程中，重視本病臨床癥狀特征，遵從圍絕經(jīng)期婦女生理特點，兼顧人體陽氣，遵從“天之大寶只此一輪紅日，人之大寶只此一息真陽”理論，選用“溫而不燥，為燮理陰陽之佳品”的仙靈脾配合熟地黃以滋補腎陰，培補腎氣，臨床使用最善調(diào)節(jié)女性內(nèi)分泌；柴胡、郁金疏肝解郁，活血行滯；半夏化痰除濕，和胃健脾，交通陰陽；茯苓、人參相伍健脾養(yǎng)心安神。全方陰陽兼顧，補腎疏肝，兼有活血化痰、養(yǎng)心健脾之功，切合圍絕經(jīng)期抑郁癥陰陽失調(diào)，腎虛肝郁的基本病機。

本研究主要從大鼠行為學及血清性激素水平的角度探討了柴郁地仙方治療圍絕經(jīng)期抑郁癥的作用機理。柴郁地仙方能夠改善模型大鼠活動度降低情況，并抑制血清FSH、LH過渡分泌，使E2保持較為正常的水平，說明本方在抗PDD過程中能夠?qū)PG軸產(chǎn)生影響。值得注意的是，柴郁地仙方對PDD模型大鼠有長期的抗抑郁癥作用，且在短期時間內(nèi)對行為學影響效果比臨床抗抑郁常用藥鹽酸氟西汀效果顯著，而其在對HPG軸的作用上效果優(yōu)于鹽酸氟西汀，與雌激素替代療法常用藥戊酸雌二醇效果相當。臨床上對單純抗抑郁治療效果不明顯的中年女性補充雌激素，能夠明顯改善抑郁癥狀，提示PDD的發(fā)病過程與HPG軸功能紊亂相關(guān)[12]，因此，尋得一種兼具抗抑郁與調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌效果的治療方案有助于降低該病造成的社會負擔。柴郁地仙方能夠在改善患者抑郁狀態(tài)的同時糾正HPG軸的紊亂，值得在PDD治療中推廣應(yīng)用。

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福建省衛(wèi)生廳資助項目(No.WZPW201307)

▲通訊作者 朱紅梅，女，教授，主要從事經(jīng)方治療婦科病及圍絕經(jīng)期抑郁癥相關(guān)研究。E-mail：z5913778@126.com

廈門大學醫(yī)學院(361000)