李淑珍　武　飛　陳月林　楊　穎

1.烏蘭察布醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，內(nèi)蒙古　烏蘭察布　012000；

2.內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布中心醫(yī)院，內(nèi)蒙古　烏蘭察布　012000

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沙棘葉總黃酮的提取工藝優(yōu)化

李淑珍1武飛2*陳月林1楊穎1

1.烏蘭察布醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000；

2.內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布中心醫(yī)院，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000

【摘要】目的：對(duì)沙棘葉總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法：采用溶劑浸提法提取沙棘葉總黃酮，利用分光光度法測(cè)定總黃酮的含量，正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果：取7月份沙棘葉粉碎物，過35目篩，經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的提供工藝為：用60%的乙醇作溶劑，固液比為1∶20，在80℃提取30min，用此方法100g葉粉碎物經(jīng)提取可得8.71g粗制品，總黃酮提取率達(dá)0.14%。結(jié)論：上述工藝操作簡(jiǎn)單、方法可靠，產(chǎn)品得率高，提取性能較好，適合于沙棘總黃酮大規(guī)模提取。

【關(guān)鍵詞】沙棘葉；總黃酮；提取工藝；正交試驗(yàn)

沙棘(HippopherhamnoidsL.)屬胡頹子科沙棘屬植物，又名醋柳，被國(guó)際醫(yī)藥學(xué)家和營(yíng)養(yǎng)學(xué)家譽(yù)為人類21世紀(jì)最具發(fā)展前途的醫(yī)藥及營(yíng)養(yǎng)保健植物。其根、莖、葉、果實(shí)等都含有維生素、黃酮類化合物和豐富的礦物質(zhì)元素等，為藥食同源植物，并廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域[1]。沙棘1977年收載于《中華人民共和國(guó)藥典》，所含的黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌、降血糖、保護(hù)心血管等多種生物活性[2-3]。內(nèi)蒙古沙棘資源具有分布廣、種植面積大、果實(shí)質(zhì)量高等特點(diǎn)，對(duì)沙棘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展十分有利。且沙棘作為防護(hù)林發(fā)揮著巨大作用，種植面積也逐年增加。而沙棘果實(shí)黃酮的開發(fā)已經(jīng)報(bào)道很多[4-5]，從葉中提取黃酮類化合物也具有原料來源廣泛、成本低廉的優(yōu)勢(shì)[6]。研究從沙棘葉提取黃酮，旨在篩選適合沙棘葉黃酮的提取工藝，獲取高含量的總黃酮，促進(jìn)沙棘資源的綜合利用。

1儀器與試劑

1.1儀器722可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；DZKW-S-8電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；RE-52旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；101-2型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱(上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2材料沙棘葉采于內(nèi)蒙古烏蘭察布市(集寧區(qū))卓資縣郊野，經(jīng)楊鴻飛教授鑒定沙棘(HippopherhamnoidsL.)的葉。并將其充分粉碎，過35目篩，置于干燥器中備用。蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：100080-201407，中國(guó)藥品生物制品檢定所)。其他試劑均為分析純。

2方法及結(jié)果

2.1沙棘葉總黃酮含量的測(cè)定

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作準(zhǔn)確稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20mg，用70%的乙醇溶解并定容至100ml，使其濃度為200μg/ml。分別取10、15、20、25、30、35、40、45ml，用70%的乙醇定容50ml，即為40、60、80、100、120、140、160、180μg/ml的蘆丁溶液。各取1ml于試管中，加70%的乙醇1ml，加入0.5ml 5%的NaNO2，混勻后放置6min；然后加入0.5ml 10%的Al(NO3)3溶液，搖勻后放置6min；最后再加入6ml 4%NaOH，放置15min，在510nm處測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值(亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法)。以吸光度為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：Y=477.38X-2.261(R=0.9979)，結(jié)果表明蘆丁在0～120μg/ml濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.1.2樣品中黃酮含量的測(cè)定取一定量的沙棘葉黃酮樣品，配制成樣液。再取一定量總黃酮樣液，定容至某一體積。各取1ml于試管中，采用“2.1.1”項(xiàng)比色法測(cè)定吸光值，計(jì)算總黃酮含量。

X=Y×V×n×100%/m。

式中，X為樣品中總黃酮含量，Y為樣液中總黃酮濃度(mg/mL)，由回歸方程可算得；V為樣液體積(mL)；n為稀釋倍數(shù)；m為樣品量(mg)[7]。

2.2提取條件的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的選擇取8份過35目篩的6月份沙棘葉粉碎物各1g，分別加入甲醇、乙醇、水、氯仿、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇10ml，在70℃水浴加熱提取10min，過濾。用70%乙醇統(tǒng)一定容到50ml，各取1ml于試管中，采用2.1.1項(xiàng)比色法測(cè)定吸光值，計(jì)算提取率。同樣方法做3次平行試驗(yàn)，確定提取的最佳溶劑，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，沙棘總黃酮在甲醇、乙醇、水等極性溶劑中溶解度大，提取率高；在氯仿、正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、丙酮等溶劑中溶解度小，提取率低。在所測(cè)溶劑中，甲醇最好，但甲醇有毒，給操作帶來不便。由于乙醇具有、無異味、無殘留、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，且容易回收，故選用乙醇為提取溶劑。

2.2.2提取原材料的選擇取5份過35目篩的5～9月份沙棘的葉粉碎樣品各10g，加入50%乙醇150ml，在70℃水浴加熱提取30min，過濾，蒸發(fā)乙醇，用50%乙醇定容到100ml，稀釋取5ml定容到50ml的容量瓶中，取1ml于試管中，測(cè)定吸光值，計(jì)算總黃酮含量，選擇最佳提取原材料。

黃酮化合物是植物生理過程中的次生代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)的往往受到植物發(fā)育階段酶的調(diào)節(jié)和遺傳機(jī)制的控制。不同發(fā)育階段黃酮化合物含量不同。由圖2可知，5月份日照時(shí)間長(zhǎng)，植物正處在生長(zhǎng)的旺盛階段，故5月份黃酮含量高；隨后植物生長(zhǎng)變緩，合成量減少或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，故含量下降。但西北地區(qū)5月份葉子處于發(fā)芽階段，產(chǎn)量低，不宜選用。7月葉子已經(jīng)長(zhǎng)成，也未結(jié)果，又出現(xiàn)了黃酮含量的高峰，不宜用7月份葉作為實(shí)驗(yàn)原材料。

2.2.3多因素正交試驗(yàn)在單因素篩選的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)多因素試驗(yàn)表，見表1。取7月份葉粉碎樣品1g，按照下列正交試驗(yàn)條件進(jìn)行提取、過濾，用70%乙醇統(tǒng)一定容至30ml。各取1ml于試管中，測(cè)定吸光值，計(jì)算總黃酮含量，確定優(yōu)化后的提取條件。

表1　沙棘總黃酮提取條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

表2　沙棘總黃酮提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

F0.05(3，3)=9.277F0.01(3，3)=29.46

多因素正交試驗(yàn)結(jié)果見表1，直觀分析得出：葉中提取總黃酮的影響因素的順序是：C>B>A>D，即提取溫度>固液比>乙醇濃度>提取時(shí)間，優(yōu)化組合后的提取因素的選擇為A2B2C3D1。方差分析的結(jié)果見表2，影響提取沙棘總黃酮各因素均為極顯著因子(P<0.01)。綜合考慮最佳的提取條件為A2B2C3D1，即取7月份葉，用60%的乙醇作溶劑，固液比為1∶20，在80℃提取30min，提取效果較好。

2.3沙棘總黃酮的得率和含量測(cè)定準(zhǔn)確稱量沙棘7月份葉粉碎物100g，按上述確定的優(yōu)化提取條件進(jìn)行浸提，將浸提液在60℃減壓濃縮回收乙醇，將濃縮液在60℃的干燥箱干燥，稱量干燥粗制品的質(zhì)量，得到粗黃酮產(chǎn)品得率。從中取1g用70%的乙醇溶液溶解，稀釋一定倍數(shù)，取1ml測(cè)定粗制品總黃酮含量，結(jié)果見表3。

表3　沙棘總黃酮粗制品總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

由表4可知，100g葉粉碎樣品經(jīng)此提取條件提取，可得到8.71g粗黃酮產(chǎn)品，葉粗制品黃酮含量達(dá)0.14%，并且RSD為0.68%，純化后總黃酮含量達(dá)到14.89%，表明該工藝重復(fù)性強(qiáng)，穩(wěn)定可靠，精密度高。

3討論

內(nèi)蒙古沙棘資源具有分布廣、種植面積大、果實(shí)質(zhì)量高等特點(diǎn)，對(duì)沙棘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展十分有利[8]。且沙棘作為防護(hù)林發(fā)揮著巨大作用，種植面積也逐年增加。有研究發(fā)現(xiàn)沙棘所含總黃酮為葉子(876mg/100g)>果渣(502mg/100g)>鮮果汁(365mg/100g)>鮮漿果(354mg/100g)，說明從葉中提取黃酮具有重要意義[9]。對(duì)于從沙棘中提取總黃酮的方法，目前有超臨界CO2流體提取、微波法提取、超聲波法提取、有機(jī)溶劑提取、水浸提取等。超臨界CO2萃取適用于非極性化合物的分離；微波法和超聲波法提取僅限于少量提取實(shí)驗(yàn)，工業(yè)化大生產(chǎn)不宜應(yīng)用。水浸提取沙棘總黃酮提取率偏低；有機(jī)溶劑提取中甲醇和丙酮含有毒成分，因此用乙醇提取沙棘黃酮是適合工業(yè)化生產(chǎn)的適宜方法[10]。該方法經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，60%乙醇作為提取溶劑，提取30min，既節(jié)約時(shí)間，且乙醇還可以重復(fù)利用，無毒害無殘留，適合工業(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)。經(jīng)優(yōu)化工藝提取后所得葉黃酮得率為8.71%，相對(duì)較高，但黃酮含量(0.14%)較呂敏[11]采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選提取山西沙棘HippopherhamnoidsL.葉總黃酮含量(4.82%)較低，這可能與不同品種的沙棘黃酮含量不同有關(guān)。王亞輝等[12]對(duì)內(nèi)蒙古不同產(chǎn)區(qū)同一品種沙棘黃酮含量研究發(fā)現(xiàn)：內(nèi)蒙古和林格爾縣(2.5±0.07)%>內(nèi)蒙古涼城縣(2.3±0.02)%>內(nèi)蒙古東勝區(qū)(2.2±0.08)%>內(nèi)蒙古翁牛特旗(1.8±0.01)%>內(nèi)蒙古敖漢旗(1.7±0.09)%>內(nèi)蒙古集寧區(qū)(1.4±0.01)%。除集寧外，5個(gè)產(chǎn)區(qū)的總黃酮含量均達(dá)到《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)(1.5%)。實(shí)驗(yàn)選用沙棘品種恰好來自集寧區(qū)卓資山縣，提取原材料并非5月份含量最高季節(jié)采收，而是產(chǎn)量較高的7月份采收，原料只提取1次，而呂敏實(shí)驗(yàn)提取三次，所以該實(shí)驗(yàn)黃酮含量相對(duì)較低。與其他研究結(jié)果比較[13-15]，產(chǎn)品得率較高，并且該提取工藝操作簡(jiǎn)單、乙醇無殘留可重復(fù)利用，適合于沙棘總黃酮的提取，可進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)。

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Optimize total flavonoids extraction process from leaves of Hippophae rhamnoides L．

LI Shuzhen1WU Fei2*CHEN Yuelin1YANG Ying1

1.Wulanchabu medical college, Inner Mongolia , wulanchabu 012000,China;

2. Wulanchabu central hospital,Inner Mongolia,wulanchabu 012000,China

Abstract:Objective The optimize total flavonoids extraction technology of Hippophae rhamnoides L．leaves. Methods Solvent-extraction process was used for flavonoids extraction,spectrophotometry was used to analyze the contents and the orthogonal experiment was used to optimize extraction process．Results The extraction materials were leaves of Hippophae rhamnoides L. in July,which was crushed 35 mesh. The optimum extracted conditions were 80℃, 1∶20(W/V),extracting 30 min for each time, the flavonoids content of product reached to 0.14 % , product yield was 8.71%.Conclusion The total flavones from leaves of Hippophae rhamnoides L. can be extracted by above-mentioned method, this process was simple, reliable and can get high purity product and ethanol can be reused repeatedly,the process suitable for mass production the total flavones.

Key words:Leaves of Hippophae rhamnoides L.; Total flavonoids; Extraction process; The orthogonal experiment

(收稿日期：2015.09.23)

【中圖分類號(hào)】R284.2

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2016)01-0014-03

作者簡(jiǎn)介：李淑珍(1974-)，女，蒙古族，碩士研究生，副教授，主要從事天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。E-mail：448609108@qq.com通信作者：武飛(1976-)，男，蒙古族，碩士研究生，副主任醫(yī)師，主要從事新藥研發(fā)。E-mail：wufeiyisheng0812@126.com

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(NJZC14407)。