田　莉，張慧慧，謝　莉，暢　靜， 高曉黎

(1新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院； 2新疆名醫(yī)名方與特色方劑學重點實驗室； 3新疆醫(yī)科大學藥學院， 烏魯木齊　830011)

?

大鼠在體單向腸灌流模型研究石榴皮多酚中鞣花酸的腸吸收動力學

田莉1,2，張慧慧1，謝莉1，暢靜1， 高曉黎3

(1新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院；2新疆名醫(yī)名方與特色方劑學重點實驗室；3新疆醫(yī)科大學藥學院， 烏魯木齊830011)

摘要：目的考察石榴皮多酚中鞣花酸的大鼠在體腸吸收動力學特征。方法采用大鼠在體單向腸灌流模型，選用HPLC法測定灌流液中鞣花酸在大鼠不同腸段以及在不同質量濃度下的吸收情況。結果鞣花酸在不同腸段均有吸收，在實驗濃度范圍內，大鼠十二指腸、空腸、回腸和結腸中鞣花酸單體的吸收速率常數(shù)(Ka)分別為4.44×10-2～7.11×10-2/min、6.58×10-2～8.60×10-2/min、5.61×10-2～7.02×10-2/min、3.92×10-2～5.95×10-2/min；石榴皮多酚精制物中鞣花酸的Ka分別為7.00×10-2～7.81×10-2/min、6.32×10-2～7.96×10-2/min、4.97×10-2～5.58×10-2/min、3.50×10-2～4.68×10-2/min。鞣花酸單體和石榴皮多酚精制物中的鞣花酸的Ka和表觀滲透系數(shù)(Papp)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論鞣花酸在大鼠腸道內不存在特殊“吸收窗”，石榴皮多酚精制物中的其他成分可能對鞣花酸的吸收有促進作用，在不同腸段鞣花酸的質量濃度對Ka和Papp值影響不大，吸收機制可能為主動轉運。

關鍵詞：石榴皮多酚； 鞣花酸； 腸吸收； 單向腸灌流模型； HPLC

石榴多酚主要分布于石榴皮中，含有安石榴苷、鞣花酸、沒食子酸、兒茶素、原花青素及少量黃酮類等多酚成分[1-2]。鞣花酸是一種可水解的單寧物質，為沒食子酸的二聚衍生物，約占石榴皮多酚的20%[3]，分子式為C14H6O8，分子量為302.28?，F(xiàn)代研究表明，鞣花酸體內外均具有很強的抗氧化活性，具有抑制腫瘤生長及抗動脈粥樣硬化等作用[4-5]。藥物腸吸收動力學特性在一定程度上可反映藥物口服后的整體吸收情況，是決定口服藥物生物利用度的重要因素之一，可為藥物制劑設計提供生物學依據(jù)。本實驗采用大鼠在體單向腸灌流法，考察石榴皮多酚中鞣花酸的腸吸收特性，為其劑型設計和臨床應用提供藥動學依據(jù)。

1儀器與材料

1.1實驗儀器Agilent1220型高效液相色譜儀(安捷倫公司)，DKZ型系列恒溫振蕩浴槽(上海恒科學儀器有限公司)，XS105型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，TDL-40B型高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)，752型紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)。

1.2藥品與試劑石榴皮多酚提取物(新疆醫(yī)科大學藥學院制備)，經HPLC測定，鞣花酸含量為19.22%，鞣花酸對照品(成都曼思特生物科技有限公司，生產批號：MUST-13010903，純度≥98%)，甲醇(Fisher Scientific，色譜純)，水為雙蒸水；其余試劑均為分析純。

1.3實驗動物健康雌性SD大鼠，SPF級，體質量(200±10)g，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK(新)2011-0004。

2方法與結果

2.1色譜條件YMC-Triart C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：甲醇∶0.4%磷酸(55∶45)，柱溫35℃，檢測波長254 nm，流速1 mL/min，進樣量10 μL。理論塔板數(shù)按鞣花酸峰面積總和計算不低于2 000，分離度R>1.5，拖尾因子在0.95~1.05范圍內，符合檢測分析條件。

2.2溶液的配制

2.2.1鞣花酸對照品儲備液精密稱取鞣花酸對照品適量置于25 mL棕色容量瓶中，加入少量二甲基亞砜(DMSO)溶解，再用甲醇稀釋至刻度，即得濃度為230 μg/mL鞣花酸對照品儲備液。

2.2.2Krebs-Ringer’s 腸營養(yǎng)液配制現(xiàn)配制的K-R液每升中含有NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、NaH2PO40.32 g、NaHCO31.37 g、MgCl20.02 g、葡萄糖1.4 g。

2.2.3鞣花酸腸灌注液精密稱取鞣花酸對照品適量，用K-R液稀釋定容至100 mL，配制成濃度分別為53.81、131.70 μg/mL的鞣花酸腸灌流液。

2.2.4石榴皮多酚精制物腸灌注液精密稱取石榴皮多酚精制物適量，用K-R液稀釋定容至100 mL，配制成濃度分別為279.97、685.22 μg/mL的石榴皮多酚精制物腸灌流液。

2.2.5空白腸灌注液用37℃生理鹽水將腸內容物沖洗干凈后，用不含藥物的K-R液迅速充盈腸段，以0.2 mL/min 的速度連續(xù)泵入腸段，在出口處收集流出液，作為空白腸灌注液。

2.3樣品處理取樣品液2 mL置于離心機中，10 000 r/min離心10 min，取上清液過濾，取續(xù)濾液10 μL進樣測定。

2.4方法學考察

2.4.1專屬性考察取空白腸灌注液、鞣花酸對照品液、單體腸灌注液樣品、石榴皮多酚精制物腸灌注液樣品分別進樣10 μL，按“2.1”項下色譜條件測定，鞣花酸對照品與鞣花酸腸灌注液特征峰保留時間一致，空白腸灌注液無干擾，見圖1。

2.4.2線性范圍考察精密吸取鞣花酸對照品儲備液各0.1、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、14.0 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積。以峰面積(A)對含量(X，μg)進行回歸，得回歸方程為A=30 283 359X-88 795(r2=0.999 9)，表明鞣花酸在0.023~3.220 μg濃度范圍內線性關系良好。

2.4.3精密度試驗 取不同體積鞣花酸對照品儲備液，置10 mL棕色容量瓶中，用K-R液稀釋至刻度，得鞣花酸高(230.00 μg/mL)、中(115.00 μg/mL)、低(57.50 μg/mL)濃度的對照品工作液。以1 d內測定5次，計算日內精密度；連續(xù)測定3 d，計算日間精密度。鞣花酸對照液高、中、低濃度的日間精密度RSD值分別為3.00%、3.91%、2.30%；日內精密度RSD值分別為4.48%、5.22%、3.51%，表明儀器精密度良好。

A：空白腸灌注液

B：鞣花酸對照品

C：鞣花酸單體腸吸收樣品

D：石榴皮多酚精制物腸吸收樣品

圖1鞣花酸HPLC色譜圖

2.4.4穩(wěn)定性試驗取高、中、低濃度鞣花酸對照品工作液，每個濃度平行制備4份樣品，分別考察在常溫、37℃及4℃下保存4 h(每小時測定1次)、-20℃冷凍放置3 d的穩(wěn)定性。結果測得不同濃度鞣花酸在不同考察條件下的RSD值為0.92%~5.93%，表明K-R液中樣品在上述條件下均穩(wěn)定。

2.4.5方法回收率試驗空白灌流液中加入鞣花酸對照品，分別配制230.00、115.00、57.50 μg∕mL的溶液，按“2.3”項下方法進行處理，每個質量濃度平行制備3份，測定，計算得方法平均回收率分別為98.39%、97.77%、101.53%；RSD%值分別為7.84%、10.17%、7.73%，符合測定要求。

2.5鞣花酸的大鼠在體單向腸灌流實驗

2.5.1藥物在蠕動泵管路中的物理吸附及攝取考察配置鞣花酸濃度為230.00 μg/mL和57.50 μg/mL的腸灌流液，使用蠕動泵裝置，流速0.2 mL/min，分別在 0、1、2、3 h取適量流出液，測定鞣花酸峰面積，計算RSD值。結果測得高、低濃度鞣花酸的RSD值分別為2.48%、1.16%，說明蠕動泵管路對鞣花酸幾乎無吸收攝取作用。

2.5.2腸壁對鞣花酸的物理吸附、攝取、代謝的考察取大鼠空白腸段，剖開，翻轉腸壁，用生理鹽水反復沖洗多次，置于115.00 μg/mL供試液中，37℃恒溫水浴鍋中孵育3 h后測定供試液中鞣花酸的含量，計算得孵育液中鞣花酸的剩余百分率為(95.56±0.01)%(n=3)，表明大鼠腸壁對鞣花酸無明顯吸附、攝取或代謝。

2.5.3大鼠在體腸灌流實驗方法[6]取禁食12 h (自由飲水) SD大鼠，腹腔注射10% 水合氯醛溶液麻醉，背部固定，控溫燈保持體溫37℃，沿腹中線打開腹腔約3 cm，分離長度約10 cm待考察腸段，于兩端切口并插入蠕動泵管，進入端連接恒流泵，用37℃生理鹽水沖凈內容物，用空氣排盡生理鹽水，以浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋腹腔。

將腸灌流液迅速泵入考察腸段，待腸段內充滿藥液后，流速調至 0.2 mL/min，待流速穩(wěn)定且吸收達平衡后(約30 min)開始實驗。入口處用裝有供試液的帶蓋小瓶進行灌流，出口處連接作為接收瓶的帶蓋小瓶，每隔 15 min進行一組實驗，快速更換樣品液小瓶和收集液小瓶，直至實驗結束。稱量樣品瓶和收集瓶，計算灌入和收集的供試液含量。實驗結束后，剪下所灌注腸段，測量其長度和周長。按“2.1”項下色譜條件進樣分析，測定鞣花酸濃度。

式中Cin和Cout分別為進出口灌注液的濃度(μg/mL)；Qin和Qout分別為進出口灌注液的體積(mL)；Q為灌流速度；V為灌流腸段的體積(cm3)；r和l分別為灌流腸段的半徑(cm)和長度(cm)。

2.6 鞣花酸在各腸段的Ka和Papp統(tǒng)計學分析分別對各腸段的高、低劑量組求得的Ka和Papp進行隨機區(qū)組方差分析。結果顯示，鞣花酸單體在各腸段的Ka值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Papp值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。低濃度時的吸收速率常數(shù)：空腸>回腸>十二指腸>結腸；高濃度時的吸收速率常數(shù)：十二指腸>回腸>空腸>結腸；石榴皮多酚精制物中鞣花酸在各腸段的Ka值差異有統(tǒng)計學意義，低濃度時，十二指腸>空腸>回腸>結腸；高濃度時，空腸>十二指腸>回腸>結腸。根據(jù)Papp>0.2×10-4cm/s時，藥物吸收完全[7]，判斷吸收性能鞣花酸在整個腸段吸收良好，其中鞣花酸單體在回腸的Papp最高，表明在此腸段具有較好的吸收，而石榴皮多酚精制物中的鞣花酸在各腸段的Papp無統(tǒng)計學意義。在同一腸段下，鞣花酸單體和石榴皮多酚精制物中鞣花酸的Ka和Papp有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，后者優(yōu)于前者，見表1、2。

3討論

在體腸段灌流模型是一種原位實驗模型，通過測定藥物經過腸段后在灌流液中減少的量來估算藥物的Ka和Papp，與其他模型相比，在體腸段灌流模型既能保證腸道神經和內分泌系統(tǒng)的完好，又能避免胃腸道內容物對指標成分吸收的影響，同時可通過藥物剩余量來計算相關吸收參數(shù)，有助于排除首過效應及藥物在胃腸道中的吸附、攝取、代謝等生物轉化，相對于體外實驗，該法測得的相關吸收參數(shù)可更真實地反映指標成分的透膜特性[8]。單向灌流法以約0.2 mL/min的較低流速灌流藥液，能較好模擬腸道正常蠕動狀態(tài)，從而能更好地預測藥物在腸道的吸收情況，近年來國內外大多采用“單向灌流法”來研究藥物的腸吸收[9]。本研究采用大鼠在體單向灌流腸吸收模型，低流速進行腸段灌流，考察鞣花酸單體和石榴皮多酚精制物中鞣花酸在不同腸段灌注液中藥物含量的變化。

表1　鞣花酸在各腸段的吸收速率常數(shù) (Ka )(±s， n=5)

注：與高濃度比較，*P<0.05。

表2　鞣花酸在各腸段的藥物表觀吸收系數(shù)(Papp)(±s， n=5)

注：與高濃度比較，*P<0.05。

實驗過程中，灌流液中藥物量的減少，不僅是胃腸道吸收了藥物，胃腸壁的物理吸附、細胞對藥物的攝取以及腸道菌或酶對藥物的代謝等也會導致藥物含量的降低[8]。本實驗考察腸壁對鞣花酸的吸附結果表明，大鼠腸壁對其并無明顯的吸附、攝取或代謝。

鞣花酸在不同腸段均有吸收，其在大鼠腸道內不存在特殊“吸收窗”。 鞣花酸高、低劑量在大鼠小腸內的腸吸收Ka和Papp值差異有統(tǒng)計學意義，表明鞣花酸有自身濃度抑制作用，在此濃度范圍內可能以主動轉運吸收進入體循環(huán)。石榴皮多酚精制物中鞣花酸的吸收速率常數(shù)Ka和表觀吸收系數(shù)Papp均優(yōu)于鞣花酸單體，這可能是石榴皮多酚精制物中某種或某些成分對鞣花酸的吸收有促進作用，有待進一步研究確證。

參考文獻：

[1]Olaniyi AF, Nokwanda PM, Umezuruike LO. Antibacterial, antioxidant and tyrosinase-inhibition activities of pomegranate fruit peel methanolic extract[J]. BMC Complement Altern Med, 2012, 12: 200-202.

[2]Fawole OA, Opara UL, Theron KI. Chemical and phytochemical properties and antioxidant activities of three pomegranate cultivars grown in south Africa[J]. Food Bioprocess Tech, 2012, 5(7): 2934- 2940.

[3]丁楠,高曉黎.HPLC法測定石榴皮提取物中鞣花酸的含量[J].新疆醫(yī)科大學學報,2012,35(6): 770-772.

[4]Jimenez DR，Ramazanov A，Sikorski S, et al. A new method of standartization of health-promoting pomegranate fruit ( Punica granatum) extract[J]. J Georgian Med News, 2006, 140: 70-77.

[5]熱依木古麗·阿布都拉,來海中,馬依努爾·拜克力,等.石榴皮化學成分及生物活性研究進展[J]. 新疆醫(yī)科大學學報,2013,36(6):737-740.

[6]徐本亮,王冰,浦益瓊,等.丹皮酚平衡溶解度與油水分配系數(shù)測定及大鼠在體腸吸收研究[J].中成藥 2012,34(10) :1892-1896.

[7]Fagerholm U, Johansson M, Lennernas H. Comparison between permeability coefficients in rat and human jejunum[J]. Pharm Res,1996,13(9) : 1336-1342．

[8]Tang TT, Hu XB, Liao DH, et al. Mechanisms of microemulsion enhancing the oral bioavailability of puerarin: comparison between oil-in-water and water-in-oil microemulsions using the single-pass intestinal perfusion method and a chylomicron flow blocking approach[J]. Int J Nanomedicine, 2013, 8: 4415-4426.

[9]Yu F, He C, Waddad AY, et al. N-oct-yl-N-argininechitosan (OACS) micelles for gambogic acid oral delivery: preparation, characterization and its study on in situ intestinal perfusion[J].Drug Dev Ind Pharm, 2014, 40(6): 774-782.

(本文編輯施洋)

Intestinal absorption dynamics study on ellagic acid of pomegranate peel polyphenols by in situ single-pass perfusion model in rats

TIAN Li1,2，ZHANG Huihui1， XIE Li1， CHANG Jing1， GAO Xiaoli3

(1CollegeofTCM,XinjiangMedicalUniversity；2XinjiangKeyLaboratoryofFamousPrescription

andScienceofFormula；3CollegeofPharmacy，XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo study the intestinal absorption kinetics of ellagic acid of pomegranate peel polyphenols in rats. MethodsA single-pass intestinal perfusion model was used to measure the intestinal absorption of ellagic acid in different absorption segments and the content of ellagic acid was assayed by HPLC method. The effect of mass concentrations on intestinal absorption was detected. ResultsEllagic acid could be absorbed in the whole intestine，and its absorption rate was influenced by the intestinal segments. The absorption rate of ellagic acid in duodenum，jejunum，ileum and colon was 4.44×10-2～7.11×10-2/min， 6.58×10-2～8.60×10-2/min， 5.61×10-2～7.02×10-2/min， 3.92×10-2～5.95×10-2/min， respecvticvely； The absorption rate of ellagic acid in pomegranate peel polyphenols purification in duodenum， jejunum， ileum and colon was 7.00×10-2～7.81×10-2/min， 6.32×10-2～7.96×10-2/min， 4.97×10-2～5.58×10-2/min， 3.50×10-2～4.68×10-2/min respecvticvely. The Ka and Pappof ellagic acid monomers and the ellagic acid in pomegranate peel polyphenols extraction have significant difference (P<0.05). ConclusionEllagic acid has no a special “absorption window”. Some compositions of polyphenol extractions may have played a catalytic role in ellagic acid absorption. The concentrations have little influence on Kaand Pappof ellagic acid in different absorption segments. The absorption of ellagic acid may active transport in the general intestinal segments.

Keywords：pomegranate peel polyphenols；ellagic acid；intestinal absorption；single-pass perfusion intestines model；HPLC

[收稿日期：2015-10-23]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.02.001

中圖分類號：R965

文獻標識碼：A

文章編號：1009-5551(2016)02-0131-05

作者簡介：田莉(1974-)，女，博士，教授，碩士生導師，研究方向：中藥民族藥新制劑研究與開發(fā)， E-mail： tianli109@126.corn。

基金項目：國家自然科學基金(81260668)；新疆醫(yī)科大學“ 天山英才工程” 專項基金(Y0382002)