周謝海， 張　龍， 楊　蘭， 程煜鳳， 李改茹

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊　830011)

?

·藥學(xué)研究·

牛血清白蛋白熒光猝滅法測定甲紫含量

周謝海， 張龍， 楊蘭， 程煜鳳， 李改茹

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊830011)

摘要：目的建立基于牛血清白蛋白(BSA)熒光猝滅測定甲紫(MV)含量的熒光分析法。方法選擇激發(fā)波長為279 nm，發(fā)射波長為340 nm，MV與BSA相互作用使其內(nèi)源性熒光產(chǎn)生猝滅，熒光強度的下降值△I與MV濃度呈線性相關(guān)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定甲紫溶液中MV的含量。結(jié)果△I與MV的濃度在2 ~10 μg/mL內(nèi)呈線性關(guān)系，△I=11.709C+0.95(r=0.999 2)，加樣回收率為97.3%~100.1%，RSD為0.24%~1.7%。3批次醫(yī)用甲紫溶液中MV的平均含量分別為1.016%、1.011%、1.029%，與標(biāo)示量一致。結(jié)論該法操作簡便，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于低含量甲紫樣品的測定。

關(guān)鍵詞：熒光猝滅法； 牛血清白蛋白； 甲紫； 含量測定

甲紫(Methyl violet, MV)又名龍膽紫、甲基紫，三苯甲烷類芳香族染料，其溶液稀釋后可用作外用藥品(紫藥水)，是皮膚科常用制劑[1]。由于其既可以殺死某些淺表真菌，又可以殺死細(xì)菌，因此常作為水產(chǎn)養(yǎng)殖抗真菌添加劑，具有較好的效果[2]。然而MV具有致癌、致畸、致突變等毒副作用，所以許多國家將其列為水產(chǎn)養(yǎng)殖的禁用藥物，也成為藥物殘留監(jiān)控的主要內(nèi)容之一[3-4]?！吨腥A人民共和國藥典》(2015版)對皮膚科外用甲紫溶液的質(zhì)量控制方法是重量分析法[5]。該法操作繁瑣，耗時長，靈敏度低。血清白蛋白是人和動物血漿中含量最豐富的重要蛋白，具有特殊位點，能與許多金屬離子、藥物分子和小分子染料產(chǎn)生特異性結(jié)合[6-7]。研究表明，MV可通過疏水作用與牛血清白蛋白(BSA)結(jié)合，使BSA內(nèi)源性熒光猝滅，且這種猝滅作用隨甲基紫濃度的增大而增強[8]。本研究據(jù)此原理，建立MV含量測定的熒光分析法，測定醫(yī)用甲紫溶液中MV的含量，現(xiàn)報道如下。

1儀器與試劑

熒光光譜儀(RF-5301PC型，日本島津公司)，牛血清白蛋白，BSA(Sigma公司，純度≥98.5%，批號：SLBG8239V)，甲紫(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號：141127)，甲紫溶液Ⅰ(河北健寧藥業(yè)有限公司，批號：140901)，甲紫溶液Ⅱ(河北武羅藥業(yè)有限公司，批號：140801)，甲紫溶液Ⅲ(廣東恒健制藥有限公司，批號：140611)，三羥甲基氨基甲烷，Tris(Sigma公司，純度≥98.5%，批號：WXBB4339V)，其余試劑均為分析純，實驗用水為二次重蒸水。

2方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備準(zhǔn)確稱取0.10 g甲紫，以無水乙醇溶解，用水定容至100 mL，配制成1 mg/L甲紫對照品溶液；另準(zhǔn)確稱取0.50 g牛血清白蛋白，以0.05 mol/L氯化鈉水溶液定容至100 mL，配制成5 mg/L儲備液，4℃冰箱保存，備用。

2.2供試品溶液的制備精密移取0.2 mL甲紫溶液至100 mL容量瓶中，蒸餾水定容。取該溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，加BSA適量，用pH為7.1的Tris-HCl緩沖溶液定容，靜置10 min，待測。

2.3實驗步驟在激發(fā)波長λex=279 nm、發(fā)射波長λem=340 nm條件下，測定系列甲紫對照品對BSA的熒光猝滅信號△I，以△I對甲紫濃度繪制校準(zhǔn)曲線；同法測供試品，代入回歸方程求取含量。

2.4甲紫與牛血清白蛋白相互作用的熒光光譜固定BSA濃度為135 μg/mL，以279 nm為激發(fā)波長，考察牛血清白蛋白-甲紫體系在340 nm處的熒光強度隨甲紫濃度增大而變化的情況。實驗結(jié)果表明，隨甲紫濃度逐漸增大，即MV濃度依次為5、10、20、40、80 μg/mL時，BSA熒光強度呈下降趨勢，但其最大發(fā)射波長保持不變，見圖1。

2.5最佳實驗條件的考察

2.5.1儀器記錄信號的穩(wěn)定性考察考慮到熒光物質(zhì)的熒光強度隨溫度升高而下降，而待測液放入樣品室的時間越長溫度越高，而導(dǎo)致其熒光強度下降，故本實驗考察待測液放入樣品室后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 min時熒光強度的變化。結(jié)果表明，BSA-MV體系在2~5 min熒光強度穩(wěn)定，5 min后熒光強度下降明顯，見圖2。

圖1　隨MV濃度增加BSA-MV體系熒光光譜變化情況

圖2　儀器記錄信號的穩(wěn)定性考察

2.5.2最佳pH 的選擇分別考察不同pH值的Tris-HCl緩沖溶液對BSA-MV體系熒光強度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)Tris-HCl緩沖液 pH為7.1時，體系的熒光強度最大，見圖3。

圖3　不同pH值對BSA-MV體系熒光強度的影響

2.5.3BSA-MV體系穩(wěn)定性考察為了考察BSA-MV體系的穩(wěn)定性，本實驗固定甲紫與牛血清白蛋白濃度，分別考察了BSA-MV體系在反應(yīng)了0、5、10、15、30、60 min時的熒光強度，結(jié)果表明，測定體系在室溫下反應(yīng)10 min時熒光強度達(dá)到最大，30min后趨于穩(wěn)定，見圖4。

2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備固定BSA濃度為135 μg/mL，取“2.1”項下甲紫對照品溶液制成2、4、6、8、10 μg/mL系列BSA-MV測定溶液，按“2.3”項下光譜條件測定，以熒光強度下降值△I對MV濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為△I=11.709C+0.95，相關(guān)系數(shù)r=0.999 2。說明MV對BSA的熒光猝滅信號與MV濃度線性顯著相關(guān)。

圖4　BSA-MV體系穩(wěn)定性考察

2.7精密度試驗固定BSA濃度為135 μg/mL，準(zhǔn)確量取適量甲紫對照品溶液于10 mL容量瓶中，用pH為7.1的Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度，配制成2、6、10 μg/mL溶液各3份，按“2.3”項下實驗步驟，測得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.52%~2.8%。

2.8回收率試驗精密移取供試品溶液0.5 mL，按照高、中、低濃度加入甲紫對照溶液1.0、0.4、0.2 mL制成系列測定溶液(n=9)。按“2.3”項下條件測定，并計算回收率，結(jié)果表明平均回收率為97.3%~100.1%，RSD為0.24%~1.7%。

2.9樣品測定按“2.3”項下條件，分別測定了3批供試品，即甲紫溶液Ⅰ、甲紫溶液Ⅱ和甲紫溶液Ⅲ中MV含量，結(jié)果3批甲紫溶液中MV平均含量分別為1.016%、1.011%、1.029%，與標(biāo)示量一致，見表1。

表1　3批甲紫溶液中甲紫含量(g/100 mL)

3結(jié)論

熒光是發(fā)射光，是分子、原子吸收光輻射被激發(fā)，然后發(fā)射出比吸收波長更長的光，是光致發(fā)光現(xiàn)象。熒光分析法具有靈敏度高、選擇性好、簡單快速，且取樣量少等特點[9]，是藥品質(zhì)量控制中常用的儀器分析法之一。

BSA的內(nèi)源性熒光主要來源于BSA內(nèi)部的色氨酸殘基和酪氨酸殘基[10]，當(dāng)MV與BSA通過疏水作用結(jié)合時，BSA 中熒光發(fā)色團(tuán)的微環(huán)境及蛋白質(zhì)分子構(gòu)象行為的變化，使BSA的熒光強度下降[11~12]?；诖嗽恚狙芯渴紫瓤疾炝薆SA與MV作用的最佳實驗條件，然后建立了測定MV的熒光猝滅分析法。結(jié)果表明，在pH為7.1的Tris-HCl緩沖溶液中，BSA-MV體系在室溫下放置約30 min后趨于穩(wěn)定，說明此時BSA與MV相互作用完全，因此本研究選擇BSA-MV的作用時間為30min。并確保樣品池放入儀器室中在5 min內(nèi)完成信號測量，以免放置時間過長樣品室內(nèi)溫度升高使信號降低，影響測量的穩(wěn)定性。在所確定的最佳實驗條件下，BSA-MV體系的熒光強度下降值△I在MV濃度為2 ~10 μg/mL內(nèi)呈線性關(guān)系，△I=11.709C+0.95(r=0.999 2)，加樣回收率為97.3%~100.1%，RSD為0.24%~1.7%，符合方法學(xué)要求。用此法測定了3個批次醫(yī)用甲紫溶液的含量，結(jié)果與標(biāo)示量一致。該法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，靈敏度高，適合低含量甲紫樣品的測定。

參考文獻(xiàn):

[1]Solpana D, Duran S, Saraydin D, et al. Adsorption of methyl violet in aqueous solutions by poly(acrylamide-co-acrylic acid) hydrogels[J]. Radiation Physics and Chemistry, 2003, 66(2):117-127.

[2]Mittal AK, Gupta SK. Biosorption of cationic dyes by dead macro fungus Fomitopsis carnes: batch studies [J].Water Science and Technology, 1996, 34(10):81-87.

[3]趙玲子，遲赫，滕洪輝,等.甲基紫對牛血清白蛋白毒性作用的光譜學(xué)研究[J].遼寧化工，2011, 40(12):1237-1240.

[4]肖虎鵬, 周小理, 韓生. CE-UV-Vis法測定鯽魚中結(jié)晶紫[J]. 化學(xué)世界, 2012, 53(1):13-23.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2015:219-220.

[6]羅宗銘,張熳,崔英德,等.蛋白質(zhì)與酸性染料相互作用的分光光度研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,2001,21(11): 251-253.

[7]吳剛珂,顏承農(nóng),劉義.熒光分光光度法研究對乙酰氨基酚與牛血清白蛋白之間的相互作用[J].化學(xué)分冊,2007, 43(11): 964-967.

[8]尹愛萍,白佛,李慧卿.甲基紫與牛血清白蛋白作用的熒光光譜研究[J].分析試驗室,2012, 31(2): 71-74.

[9]郭德濟(jì).光化學(xué)分析法[M].重慶:重慶大學(xué)出版社,1990:173．

[10]陳芳,陳妍,張彥崢,等.牛血清白蛋白的熒光穩(wěn)定性研究[J].應(yīng)用化工,2011,40(9): 1508-1511.

[11]譚幗馨,崔英德,肖楚民.牛血清白蛋白與光譜探針相互作用機理的研究[J].分析試驗室，2005, 24(10): 26-28.

[12]彭貞,張忠平,薛建躍.結(jié)晶紫與蛋白質(zhì)相互作用的電化學(xué)行為的研究[J].化學(xué)世界,2006, 47(2):78-80.

(本文編輯施洋)

Determination of methyl violet by fluorescence quenching method base on the interaction of bovine serum albumin with methyl violet

ZHOU Xiehai, ZHANG Long, YANG Lan, CHENG Yufeng, LI Gairu

(CollegeofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a quantitative analysis of Methyl violet(MV) by fluorescence spectroscopy. MethodsAt an excitation wavelength of 279 nm and an emission wavelength of 340 nm, the entogenous fluorescence of bovine serum albumin (BSA) was quenched as the interaction of bovine serum albumin with methyl violet. The decrease of fluorescence △I and the MV concentration showed a linear correlation. The content of MV in Methylrosanilinium Chloride Solution was determined by calibration curve method. ResultsThe △I showed a good liner relation with the concentration of the MV in 2~10 μg/mL, △I=11.709C+0.95(r=0.999 2). The recovery was 97.0%~100.4%, and RSD was 0.24%~1.7%. Three batches of medical Methylrosanilinium Chloride Solution were determined, and the average concentrations were 1.016%, 1.011%, 1.029%，respectively，which were consistent with the labeled amounts. ConclusionThe proposed method is simple, accurate and sensitive, and it can be applied to determine the trace amount of the Methyl violet.

Keywords:fluorescence quenching method; bovine serum albumin (BSA); Methyl violet; quantitative analysis

[收稿日期：2015-11-9]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.02.013

中圖分類號：R914

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-5551(2016)02-0184-03

作者簡介：周謝海(1992-)，女，在讀本科，研究方向：藥物分析。通信作者：李改茹，女，碩士，副教授，研究方向：藥物分析，E-mail:gruli104@163.com。

基金項目：新疆醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新基金(CX2014031)