施　洋，孫　蕓，謝　莉，田　莉

(新疆醫(yī)科大學(xué)1學(xué)報(bào)編輯部, 2中醫(yī)學(xué)院, 3新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊　830011)

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石榴皮中活性成分鞣花酸的平衡溶解度與油水分配系數(shù)的測(cè)定

施洋1,2，孫蕓2,3，謝莉2，田莉2,3

(新疆醫(yī)科大學(xué)1學(xué)報(bào)編輯部,2中醫(yī)學(xué)院,3新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830011)

摘要：目的考察鞣花酸在25℃和37℃下不同 pH 磷酸鹽緩沖液中的平衡溶解度與表觀油水分配系數(shù)(Papp)。方法采用紫外-可見分光光度法測(cè)定鞣花酸在不同 pH 緩沖液中的平衡溶解度；采用搖瓶法測(cè)定鞣花酸的Papp值。結(jié)果25℃時(shí)鞣花酸在pH值為1.2、2.5、5.0、5.8、6.8、7.4、7.8~8.0的磷酸鹽緩沖液中的平衡溶解度分別為2.77、4.97、8.14、6.16、1.22、1.33、1.01 g/mL，相應(yīng)條件下Papp值分別為-3.20、-2.36、-2.49、-2.50、-2.48、-2.37、-2.22；37℃時(shí)鞣花酸在上述pH 緩沖液中的平衡溶解度為3.25、5.08、8.04、6.39、1.02、1.54、1.14 g/mL，相應(yīng)條件下的Papp值分別為-2.38、-2.32、-2.38、-2.41、-2.44、-2.38、-2.18。結(jié)論鞣花酸在酸性溶液中的平衡溶解度隨pH值的升高而增大，在中性及弱堿性溶液中其溶解度較小。在pH值為1.2～8.0時(shí)，鞣花酸的Papp值均<-2，表明鞣花酸不易透過生物膜，推測(cè)其在胃腸道的吸收不好，且溫度對(duì)鞣花酸的Papp值幾乎無影響。

關(guān)鍵詞：鞣花酸；平衡溶解度；表觀油水分配系數(shù)

鞣花酸是石榴皮中的主要多酚類成分，屬于沒食子酸的二聚體衍生物，化學(xué)名為聯(lián)二沒食子酸內(nèi)酯，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗誘變、抗癌變等作用，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、化妝品、食品等領(lǐng)域[1-2]。藥物在細(xì)胞膜的滲透性與藥物的親脂性有密切的關(guān)系，直接影響藥物吸收的速度和程度，其中藥物的油水分配系數(shù)和平衡溶解度是反映藥物脂溶性不可缺少的2個(gè)重要理化參數(shù)，對(duì)研究藥物的體內(nèi)過程具有重要的意義[3]。鞣花酸微溶于水、醇，溶于堿、吡啶，不溶于醚[4]，目前對(duì)其在不同 pH 值緩沖液中理化常數(shù)的測(cè)定未見報(bào)道。本研究對(duì)鞣花酸在不同 pH值磷酸鹽緩沖溶液中的平衡溶解度以及在正辛醇/磷酸鹽緩沖液體系中的油水分配系數(shù)進(jìn)行考察，為估計(jì)該藥物透過生物膜的能力以及劑型設(shè)計(jì)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1儀器與試藥

752型紫外可見分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)，XS105型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，PHSJ-3F pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，DKZ型系列恒溫振蕩浴槽(上海恒科學(xué)儀器有限公司)，鞣花酸對(duì)照品(成都曼思特生物科技有限公司；生產(chǎn)批號(hào)：R-004-140731；HPLC≥98%)，甲醇為色譜級(jí)，二甲基亞砜(DMSO)和磷酸(sigma公司)，水為純凈水，其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1溶液的配制

2.1.1磷酸鹽緩沖液按《中國(guó)藥典》方法[5]分別配制pH為1.2、2.5、5.8、6.8、7.4、7.8～8.0的磷酸鹽緩沖液，用精密pH計(jì)測(cè)定，若有偏離，用0.1 mol/L的HCl或0.2 mol/L的NaOH校正至所需數(shù)值。

2.1.2正辛醇飽和水溶液的制備用量筒量取150 mL蒸餾水與50 mL正辛醇于具塞三角瓶中，恒溫振蕩24 h，使二者相互飽和，靜置，分層后用分液漏斗分離，保存?zhèn)溆谩Ｉ蠈訛楸凰柡偷恼链?，下層為被正辛醇飽和的水?/p>

2.1.3鞣花酸儲(chǔ)備液精密稱取鞣花酸對(duì)照品適量，加入少量二甲基亞砜(DMSO)溶解，再用甲醇定容至100 mL，得105.0 μg/mL鞣花酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，4℃保存。

2.1.4鞣花酸正辛醇溶液的配制精密稱取適量鞣花酸原料藥溶解于被水飽和的正辛醇中，制備鞣花酸的正辛醇溶液。

2.2平衡溶解度的測(cè)定

2.2.1最大吸收波長(zhǎng)的確定取鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，于200～800 nm進(jìn)行紫外可見光掃描。結(jié)果表明，鞣花酸最大紫外吸收波長(zhǎng)為254 nm，故選用254 nm作為鞣花酸的最大紫外吸收波長(zhǎng)，見圖1。

圖1　鞣花酸的最大吸收波長(zhǎng)

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密移取鞣花酸對(duì)照溶液0.12、0.17、0.22、0.27、0.32、0.37、0.42 mL于10 mL容量瓶中，分別加入“2.1.1”項(xiàng)下不同pH值緩沖溶液稀釋定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為1.260、1.785、2.310、2.835、3.360、3.885、4.410 μg/mL的鞣花酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。紫外-可見分光光度法分別測(cè)定室溫25℃和體溫37℃條件下不同pH值緩沖溶液的A值，以質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，各回歸方程在1.260~4.410 μg/mL范圍內(nèi)，均有r>0.99，表明線性關(guān)系良好，見表1。

2.2.3精密度試驗(yàn)分別精密吸取鞣花酸儲(chǔ)備液0.10、0.17、0.27 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為1.050、1.785、2.835 μg/mL的鞣花酸對(duì)照液。分別取不同濃度對(duì)照液在254 nm處測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定5次。結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度溶液的吸光度RSD值分別為0.745%、0.871%、0.429%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)分別取高、中、低濃度的鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品液各5份，分別于室溫放置0、2、4、6、8、12、24 h后按上述方法測(cè)定吸光度。結(jié)果低、中、高不同質(zhì)量濃度的鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品液的RSD平均值分別為5.27%，2.150%，0.972%(n=5)，表明鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品液于室溫存放24 h穩(wěn)定。

2.2.5平衡溶解度的測(cè)定設(shè)定室溫25℃和體溫37℃的溫度條件，取過量鞣花酸原料藥于具塞三角瓶中，分別加入“2.1.1”項(xiàng)下配制的pH分別為1.2、2.5、5.8、6.8、7.4、7.8～8.0的系列緩沖液，超聲至藥物不再溶解，放入25℃恒溫振蕩器中振搖72 h，直至鞣花酸溶液的溶解度達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)取出，于254 nm處測(cè)定吸光度，帶入相應(yīng)pH值緩沖液的線性方程。同法測(cè)定37℃時(shí)鞣花酸在pH 1.2～8.0磷酸鹽緩沖液中的平衡溶解度。室溫25℃和體溫37℃下，pH為1.2～5.8時(shí)，鞣花酸的溶解度均隨pH值的升高而增大，pH為6.8～8.0時(shí)，其溶解度驟降，這可能與其結(jié)構(gòu)中的弱堿性基團(tuán)有關(guān)，同時(shí)表明鞣花酸的平衡溶解度基本不受溫度的影響，見表2。

表1　25℃與37℃時(shí)不同pH值的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

pH25℃S/(g/mL)RSD/%37℃S/(g/mL)RSD/%1.22.77±0.001.063.25±0.001.092.54.97±0.000.085.08±0.000.425.08.14±0.020.138.04±0.000.725.86.16±0.010.086.39±0.020.266.81.22±0.010.071.02±0.010.347.41.33±0.000.451.54±0.010.37.8~8.01.01±0.010.371.14±0.010.58

2.3油水分配系數(shù)的測(cè)定

2.3.1線性考察精密吸取鞣花酸儲(chǔ)備液0.10、0.12、0.17、0.22、0.27 mL于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度為1.050、1.260、1.785、2.310、2.835 μg/mL的鞣花酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用紫外-可見分光光度法測(cè)定A值。以濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=0.255 5C-0.034 1，r=0.998 6。表明鞣花酸質(zhì)量濃度在1.050～2.835 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.3.2油水分配系數(shù)的測(cè)定取適量的鞣花酸溶解于被磷酸鹽飽和的正辛醇溶液中，制成相應(yīng)的正辛醇溶液，加入pH值為2.5、5.8、6.8、7.4、7.8～8.0的系列緩沖液5 mL作為水相，分別放入25℃和37℃的恒溫振蕩器中，振搖48 h直至平衡，6 000 r/min離心10 min，分離正辛醇層。精密稱取正辛醇層適量，甲醇定容至10 mL容量瓶，用紫外-可見分光光度法分別測(cè)定A值，根據(jù)“2.2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算質(zhì)量濃度，按公式計(jì)算鞣花酸的表觀油水分配系數(shù)(Papp)：

式中m為鞣花酸在正辛醇中的初始質(zhì)量；m。為振蕩平衡后正辛醇中鞣花酸的質(zhì)量。

結(jié)果pH值為1.2～8.0時(shí)，鞣花酸的P值均<-2，說明鞣花酸不易透過生物膜，推測(cè)其在胃腸道的吸收不會(huì)很好。室溫25℃和體溫37℃條件下鞣花酸油水分配系數(shù)相差不明顯，說明溫度對(duì)鞣花酸的Papp值幾乎無影響，見表3。

3討論

溶解度和油水分配系數(shù)與許多藥物的動(dòng)力學(xué)特征如腸吸收特性、血腦屏障滲透性等密切相關(guān)，可預(yù)測(cè)藥物在體內(nèi)的生物活性、藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)等，是劑型設(shè)計(jì)的重要參數(shù)之一。由于藥物在正辛醇-水兩相的分配系數(shù)能較好地模擬藥物分子在體內(nèi)的脂-水分配情況，故正辛醇常用于油水分配系數(shù)的測(cè)定[6-7]。本研究分別測(cè)定了在室溫25℃和體溫37℃條件下，鞣花酸在不同pH值的磷酸鹽緩沖液中的平衡溶解度和正辛醇/磷酸緩沖液體系中的表觀油水分配系數(shù)，旨在探索鞣花酸在胃腸道體液環(huán)境中的溶解度，為研究其在體內(nèi)的溶解情況和透過生物膜的能力提供理化依據(jù)。

表3　25℃與37℃時(shí)鞣花酸的表觀油水分配系數(shù)(Papp) (±s, n=5)

鞣花酸平衡溶解度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，室溫25℃和體溫37℃條件下鞣花酸平衡溶解度基本無變化，說明溫度對(duì)鞣花酸的溶解度基本無影響。不同pH值條件下，在酸性溶液中鞣花酸平衡溶解度隨pH值的升高而增大，在中性及弱堿性溶液中其溶解度驟然降低，表明在酸性溶液中隨著pH值增高鞣花酸的溶解性增加；在中性及弱堿性條件下，鞣花酸的溶解度很小，是因?yàn)轺坊ㄋ嶙鳛橐环N難溶性藥物，雖然能夠在堿性溶液中溶解，但在堿性溶液中不穩(wěn)定極易析出。

藥物只有透過細(xì)胞膜的類脂成分，才能被機(jī)體吸收，故藥物的親脂性的大小會(huì)直接影響藥物的吸收程度和速度，以及影響藥物的膜滲透性。而藥物的脂溶性不僅與藥物的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，也取決于其所處的pH條件下的分子型比例，分子型比例越大，親脂性越強(qiáng)[8]。常以lgPapp值表示油水分配系數(shù)，一般而言，具有較大油水分配系數(shù)的藥物更容易穿透細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收，親脂性化合物的lgPapp>0，數(shù)值愈大親脂性愈強(qiáng)；lgPapp<0的化合物屬親水性，數(shù)值愈小親水性愈強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)在考察鞣花酸油水分配系數(shù)時(shí)，對(duì)比室溫25℃和體溫37℃條件下鞣花酸表觀油水分配系數(shù)基本無差別，說明溫度對(duì)鞣花酸的表觀油水分配系數(shù)無影響。在pH值1.2~8.0時(shí)，鞣花酸的Papp值均<-2，且無明顯規(guī)律。說明鞣花酸不易透過生物膜，其在胃腸道的吸收性較差，可能與鞣花酸本身的分子型有關(guān)，推測(cè)其在體內(nèi)吸收的透膜方式不僅是簡(jiǎn)單地被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，還可能有主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)或促進(jìn)擴(kuò)散，有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯施洋)

Determination of equilibrium solubility and oil-water partition coefficient of ellagic acid

SHI Yang1,2，SUN Yun2,3，XIE Li2，TIAN Li2,3

(1DepartmentofJournalEditorial,XinjiangMedicalUniversity;2CollegeofTCM,

XinjiangMedicalUniversity；3XinjiangKeyLaboratoryofFamousPrescriptionand

ScienceofFormula,Urumqi830011,China)

Abstract：ObjectiveTo determine the equilibrium solubility and the apperent oli/water partion coefficient (Papp) of ellagic acid in different pH phosphate buffer solutions in 25℃ and 37℃. MethodsUltraviolet spectrophotometry was employed to determine the equilibrium solubility of ellagic acid in phosphate buffer solutions of different pH value, and the Pappvalues of ellagic acid were determined by shaking flask. ResultsAt 25℃ the equilibrium solubility of ellagic acid in different phosphate buffer solutions of pH 1.2， 2.5，5.0，5.8，6.8，7.4，7.8-8.0 were 2.77，4.97，8.14，6.16，1.22，1.33，1.01 g/mL，and the Pappvalues of ellagic acid were -3.20，-2.36，-2.49，-2.50，-2.48，-2.37，-2.22 respectively; At 37℃ the equilibrium solubility of ellagic acid in different phosphate buffer solutions of pH 1.2，2.5，5.0，5.8，6.8，7.4，7.8-8.0 were 3.25，5.08，8.04，6.39，1.02，1.54，1.14 g/mL，and the Pappvalues of ellagic acid were -2.38， -2.32， -2.38，-2.41，-2.44，-2.38，-2.18 respectively. ConclusionThe equilibrium solubility of ellagic acid is increasing with pH increases in acidic solution and its solubility is less in neutral and weak alkaline solution. The Pappvalues of ellagic acid were <-2 at the pH range from 1.2 to 8.0, which shows it is not easy to through the biological membrane and the absorption is poor in the gastrointestinal tract. The temperature has little influence on the Pappvalues of ellagic acid.

Keywords：ellagic acid; equilibrium solubility; apperent oli/water partion coefficient

[收稿日期：2015-10-23]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.02.005

中圖分類號(hào)：R943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-5551(2016)02-0145-04

作者簡(jiǎn)介：施洋(1984-)，男，碩士，編輯，研究方向：中藥民族藥活性研究。通信作者：田莉，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥民族藥新制劑研究與開發(fā)，E-mail：tianli109@126.com。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81260668)；新疆醫(yī)科大學(xué)“ 天山英才工程” 專項(xiàng)(Y0382002)