楊旭超， 西力扎提·阿不來提， 木合布力·阿布力孜， 任丙昭

(新疆醫(yī)科大學藥學院藥物化學有機教研室， 烏魯木齊　830011)

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3-甲氧基異甘草素的合成及其對宮頸癌細胞的影響

楊旭超， 西力扎提·阿不來提， 木合布力·阿布力孜， 任丙昭

(新疆醫(yī)科大學藥學院藥物化學有機教研室， 烏魯木齊830011)

摘要：目的以異甘草素(ILG)為先導化合物進行化學合成其衍生物3-甲氧基異甘草素(3-MO-ILG)，探討其體外抗宮頸癌活性。方法采用硼酸催化高溫法、羥基保護法、微波輔助堿催化法3種方法進行羥醛縮合反應而制備目標化合物；以人宮頸癌SiHa細胞為體外模型，用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法測定對癌細胞增長的抑制率；用流式細胞儀測定促進癌細胞凋亡作用，以順鉑作為陽性對照組。結果用硼酸催化高溫法、羥基保護法、微波輔助堿催化法3種方法所得到的3-甲氧基異甘草素產率分別為8.9%、9.27%和57.60%。3-甲氧基異甘草素對SiHa細胞具有較強抑制增殖作用，當藥物濃度為20 ~150 μg/mL、作用時間為24 h時，其抑制率可達93.5%；當作用時間達到72 h時，抑制率最強。3-甲氧基異甘草素在100 μg/mL時，對SiHa細胞早期凋亡率為38.6%，晚期凋亡率為1.4%，具有明顯的促細胞凋亡作用。結論微波輔助堿催化方法在查爾酮類化合物的合成中具有產率較高的方法。3-甲氧基異甘草素對SiHa細胞具有較強抑制增殖作用，并且具有明顯濃度和時間依賴性；同時對SiHa細胞具有明顯的促細胞凋亡作用。

關鍵詞：3-甲氧基異甘草素; 羥醛縮合反應； 人宮頸癌SiHa細胞； 抗癌活性

目前在全世界，子宮頸癌(cervical carcinoma)是引起婦女因癌癥死亡的主要原因之一，僅次于乳腺癌[1]。我國婦女宮頸癌的病死率大約占全世界的1/3[2]。尤其是在遺傳易感性較高的維吾爾族婦女子宮頸癌的發(fā)病率顯著高于其他民族[3]。

目前對于癌癥，化療是一種有效的治療方法，然而臨床現有的化療藥物存在毒性大和耐受性差的缺點。傳統(tǒng)天然藥物具有毒副作用少和抗癌活性較顯著等特點[4]。查爾酮廣泛分布于大多數的植物體中的黃酮類和異黃酮類生物合成最重要前體化合物，其化學結構是1,3-二苯基丙烯酮，由2個芳香環(huán)和3個碳原子的α,β-不飽和羰基連接組成，具有較大的柔性，能與不同的受體結合，呈現出廣泛的生物活性，如抗氧化[5]、抗癌[6-8]、降血糖[9]、抗組胺[10]、抗病毒[11]、細胞保護[12]及抗炎[13]。

本課題組前期研究發(fā)現，與異甘草素及其他衍生物相比較，3-甲氧基異甘草素(高紫鉚查爾酮)在低濃度時對Bel-7402細胞具有較強的抗增殖活性[14]。因此，此類化合物具有在體內研究抗癌活性的價值。由于異甘草素衍生物屬于多羥基查爾酮類化合物，在羥醛縮合反應中，多羥基查爾酮含有多個羥基，在很大程度上能夠阻礙反應進行，羥基越多反應產率越低，甚至沒有反應。

為了解決這個問題，本研究主要是針對本課題組前期利用酸性催化劑、羥基保護法和微波固相合成的方法來提高目標化合物的產率，尋找一種綠色無污染、操作簡便、成本低、產率高的方法；并選擇此方法合成異甘草素衍生物，利用人子宮頸癌SiHa細胞為體外模型，采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法和流式細胞儀法研究各衍生物對癌細胞增殖的抑制活性及促進癌細胞凋亡作用，篩選出具有抗癌活性強、對正常細胞的毒性小、不良反應少、易于臨床應用的候選藥物；為化學結構修飾及藥理活性篩選研究，為后續(xù)研究奠定重要的物質基礎。

1材料和方法

1.1儀器CW-2000 型超聲微波協(xié)同萃取儀(上海新拓分析儀器科技有限公司)，定性鑒別用TLC板(Silica gel 60 F254, merck)，旋轉蒸發(fā)儀(N-1001，上海愛朗儀器)，磁力攪拌水浴鍋(PS-1000，Tokyo Rikakikai COLTD)，恒溫循環(huán)水槽(HX-205，北京長流科學儀器)，電熱套(DRT-SX型，鄭州長城科工貿)，增力電動攪拌器(JJ-1，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器)，暗箱式自動紫外分析儀(2F-2C型上海安亭電子儀器廠)，超聲儀器(SK3200H，上?？茖С晝x器)，電子分析天平(AB104-N，梅特樂托利多)，抽濾泵(SHB-Ⅲ，鄭州長城科工貿)，WRS-1A型數字熔點測定儀(上海精密儀器)，核磁共振儀(1HNMR Varian CDCl3)。

1.2試藥2,4-二羥基苯乙酮，香草醛，中性氧化鋁，氯甲基甲醚，硼酸，乙二醇，3-甲氧基異甘草素標準品，氫氧化鉀，氫氧化鈉，無水碳酸鉀，無水硫酸鈉，冰醋酸，濃鹽酸，稀鹽酸，無水乙醇，乙醚，環(huán)己烷，丙酮，石油醚，乙酸乙酯, 柱層析硅膠(200~300目，青島海洋化工廠分廠)，上述化學試劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1合成方法 采用3種方法進行合成目標化合物：(1)硼酸催化高溫法：2,4-二羥基苯乙酮和香草醛，在以硼酸為催化劑的條件下進行羥醛縮合反應，得到目標化合物；(2)羥基保護法：采用選擇性高的羥基保護劑——氯甲基甲醚，對羥基進行保護，然后羥醛縮合，再脫保護，得到目標化合物；(3)微波輔助堿催化法：采用以中性氧化鋁為固相載體的方法，以堿為催化劑，在微波輻射的作用下得到目標化合物。如圖1所示。

1.3.2 合成操作

1.3.2.1硼酸催化高溫法(a)在三口燒瓶中依次加入香草醛4.56 g (0.03 mol)、2,4-二羥基苯乙酮4.56 g (0.03 mol)、H3BO42.00 g (0.03 mol)、乙二醇15 mL(起助溶作用)和環(huán)己烷加熱至反應溫度70~80℃時，呈液體狀；再迅速升高溫度至100℃以上，反應開始進行，羥醛縮合脫水，此時環(huán)己烷帶走水分，有利于反應向正方向移動；隨著溫度繼續(xù)升高，溶液的顏色從無色逐漸變成橙黃色，當溫度升高至120~130℃時反應6 h，溶液的顏色變成深紅棕色。將反應液倒入盛有20 mL水的燒杯中，瓶內剩余物用熱水洗出，水浴加熱燒杯，趁熱濾出上清液，清液冷卻后即析出未反應完全的香甲醛，沉淀經硅膠柱層析(Ⅴ石油醚∶Ⅴ乙酸乙酯=2∶1)洗脫，得黃色針狀結晶0.72 g，產率約8.9%。清液回收香甲醛2 g。

圖1　3-甲氧基異甘草素合成途徑

1.3.2.2羥基保護法(b)化合物IV合成：將2,4-二羥基苯乙酮7.61 g(0.05 mol)、碳酸鉀4.15 g(0.03 mol)和丙酮(200 mL)放置在500 mL圓底燒瓶中，室溫下快速滴加用丙酮50 mL稀釋的氯甲基甲醚12.5 mL(0.15 mol)溶液，加畢之后室溫下反應2 h，濾除碳酸鉀，蒸干濾液，得到淡黃色油狀物。經TLC薄層鑒定，采用硅膠柱層析分離，以Ⅴ石油醚∶Ⅴ乙酸乙酯=4∶1為洗脫劑，得到白色的粉末狀Ⅳ固體4.785 0 g，產率約為48.8%。

化合物Ⅴ合成：將香草醛7.61 g(0.05 mol)、碳酸鉀4.15 g(0.03 mol)和丙酮(200 mL)放置于500 mL圓底燒瓶中，室溫下快速滴加用丙酮50 mL稀釋的氯甲基甲醚 12.5 mL(0.15 mol)溶液，加畢之后，室溫下反應2 h，濾除碳酸鉀，Ⅴ石油醚∶Ⅴ乙酸乙酯=4∶1為洗脫劑，得到白色的粉末狀V固體4.127 6 g，產率約為42.5%。

將所得Ⅳ和Ⅴ加入適量乙醇溶解，在冰浴下滴加50%氫氧化鉀乙醇溶液(約7.2 mL)，結束之后自然升溫，在室溫下攪拌24 h，TLC跟蹤反應。反應完畢之后用乙酸乙酯萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥，所得到黃色塊狀固體Ⅳ；所得化合物VI的甲醇(約10 mL)溶解，緩慢滴加稀鹽酸，在70℃條件下攪拌回流25 min。加少量的水用乙酸乙酯(3×20 mL)萃取，合并有機相，依次用蒸餾水，飽和食鹽水洗滌，再用無水硫酸鈉干燥。除去干燥劑，減壓蒸去溶劑，用硅膠柱層析分離，得到黃色粉末狀Ⅲ固體0.475 2 g，產率約為9.27%。

1.3.2.3微波輔助堿催化合成法(c)將2,4-二羥基苯乙酮(2 mmol×5)和香草醛(2 mmol×5)與中性氧化鋁(1.6 g×5)混合均勻，加入研細的氫氧化鉀(0.8 g×5)，放置在研缽中進行充分研磨。所得混合物放入超聲-微波協(xié)同萃取儀進行微波反應，設定功率為150 W，反應時間為100 s。反應結束之后，反應生成物變成紅橙色固體，通過TCL監(jiān)測。將反應混合物冷卻到室溫，加入預先冷凍的冰蒸餾水250~300 mL進行充分攪拌溶解；然后把水不溶性固體抽濾，所得濾液用2 mol/L HCl進行酸化，并不斷充分攪拌溶液使得pH值達到1~2，出現大量的沉淀，放入冰箱中靜置10 min之后進行抽濾，用蒸餾水洗滌3次，得到黃色固體粗品，干燥后稱量得5.0 g。最后，用硅膠柱層析進行純化，以Ⅴ石油醚∶Ⅴ乙酸乙酯=2∶1為洗脫劑，收集黃色餾分，減壓蒸去有機溶劑，得黃色固體1.65 g，產率為57.60%。

1.4體外抗癌活性研究以人子宮頸癌SiHa細胞作為體外抗癌生物模型，采用MTT法測定目標化合物對子宮頸癌細胞增殖抑制活性；采用流式細胞儀技術的Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測目標化合物對癌細胞的凋亡作用，以順鉑為陽性對照組。

1.4.1樣品溶液制備將目標化合物以100% DMSO溶解之后，分別用RPMI1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基稀釋成含有5%DMSO母液，經0.22 μm過濾器除菌后備用。藥物濃度梯度12.5、25、50、100、150、200 μg/mL進行配制。將目標化合物DMSO溶液與培養(yǎng)基溶液體積之比定位藥物濃度。

1.4.2細胞培養(yǎng)在37℃和5%CO2條件下，將SiHa細胞置于含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔2~3天更換其所需培養(yǎng)基，待細胞融合度達80%時，用胰蛋白酶(0.25%)消化法以1∶3或1∶4比例傳代。

1.4.3MTT法測定細胞增殖活性取對數期的人宮頸癌SiHa細胞，接種于96孔板(1×104個/mL)，每孔200 μL，使細胞數量控制在1×104個/孔，分散均勻，培養(yǎng)24 h之后，進行藥物干預實驗；分別采用陰性對照組、陽性對照組和藥物實驗干預組。其中，陰性對照組用DMSO作為對照，陽性對照組用市售順鉑注射液作為對照，藥物實驗干預組按照12.5、25、50 、100、150、200 μg/mL的濃度梯度進行干預，分別對SiHa細胞干預24、48和72 h，最后采用酶標儀在單波長570 nm處測定OD值，按照細胞生長抑制率(IR)(%)=[(OD空白組-OD實測組)/OD空白組]×100%，計算細胞存活率和細胞抑制率。

1.4.4流式細胞儀測定細胞凋亡活性取對數期生長人宮頸癌SiHa細胞，接種于6孔培養(yǎng)板，使細胞數量控制在1×105個/孔，分散均勻，培養(yǎng)24 h之后進行藥物干預實驗；藥物實驗干預組按照高、中、低3個的濃度梯度進行配制，分別對SiHa細胞干預24 h，制成細胞懸浮液，然后1 000 r/min離心5 min，用PBS充分洗滌2次，加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入PI 5 μL，混勻，室溫、避光反應5~15 min，分別用熒光顯微鏡、流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5統(tǒng)計學處理使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，采用單因素方差分析進行同一時間點，藥物干預組與陽性對照組比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1化合物的結構鑒定化合物(E)-1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3- (3′-oximethyl-4′-hydroxyphenyl)-2- propen-1-one(3-甲氧基異甘草素)：黃色針狀結晶，mp: 192℃~194℃。不溶于水，微溶于氯仿，溶于無水乙醇和DMSO，易溶于堿性水溶液。1H-NMR(DMSO) δppm：6.39 (1H, d, J=5Hz, CH=)，6.72~6.92(3H, m, ArH)，7.45~7.69(3H, m, ArH), 7.76(1H, d, J=15Hz, CH=)，10.628(1H, s, OH)，13.67(1H, s, OH)。 IR (KBr) cm-1：3342(OH), 1628(Cα=Cβ)。 MS m/s 計算值(calcd for) C16H14O5：M+286.0828；測定值(Found)：M+286.082 0。

2.2化合物Ⅲ對SiHa細胞增殖活性采用MTT法測定目標化合物3-甲氧基異甘草素(3-MO-ILG)對人宮頸癌SiHa細胞的抑制率的實驗結果，經過反復多次實驗，當藥物濃度為50~200 μg/mL、藥物作用時間為24、48、72 h時對子宮頸癌SiHa細胞增殖的抑制率分別為29.8%~93.5%、33.2%~96%、36.7%~97.9%。在同一時間點時，隨著藥物濃度的增加，藥物對照組的細胞抑制率高于陽性對照組，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著藥物作用時間的增加，3-甲氧基異甘草素對SiHa細胞的抑制率具有較強的時間依賴性(表1)。

表1　3-MO-ILG以不同濃度在24、48和72 h對SiHa細胞抑制率/%

注：與空白對照組比較，*P<0.05。

2.3流式細胞儀測定化合物對SiHa細胞凋亡作用DMSO陰性對照組的早期凋亡率為1.8%，晚期凋亡率為0.5%；順鉑陽性對照組的早期凋亡率為16.8%，晚期凋亡率為0.2%；濃度為12.5 μg/mL的藥物干預組早期凋亡率為8.7%，晚期凋亡率為0.5%；濃度為100 μg/mL藥物干預組的早期凋亡率為38.6%，晚期凋亡率為1.4%；濃度為6.25 μg/mL藥物干預組的早期凋亡率為8.2%，晚期凋亡率為0.2%(圖2)。

3討論

鑒于傳統(tǒng)化療藥物的毒副作用大的問題，從天然藥物有效成分中篩選作用機理獨特、抗癌生物活性強而毒副作用少的新型抗癌候選藥物，已成為抗癌新藥研究熱點。異甘草素是甘草中一種含量非常微量的查爾酮類化合物，因對多種腫瘤有抑制作用而對正常細胞的毒性小而顯示出較好的天然先導化合物的潛力。本課題組前期研究發(fā)現，在查爾酮類化合物中，多羥基查爾酮的抗癌生物活性比較強，具有潛在的研究價值[14]。根據藥物設計原理，對異甘草素進行甲氧基化修飾制備甲氧基查爾酮類衍生物3-甲氧基異甘草素(3-MO-ILG, 化合物Ⅲ)。本研究試過硼酸催化高溫法和羥基保護法[15]，均沒有微波固相合成產率高。對其制備工藝進行篩選和優(yōu)化，篩選出微波固相合成方法，該方法操作方便，需要反應的時間短，綠色無污染，產率較高，可達57.60%。

注：A: 陰性對照組DMSO； B: 陽性對照組順鉑； C: 濃度為12.5 μg/mL藥物干預組； D: 濃度為100 μg/mL藥物干預組； E: 濃度為6.25 μg/mL藥物干預組。

圖33-MO-ILG對人子宮頸癌SiHa細胞凋亡作用

微波干法有機反應是將反應物在氧化鋁中進行的微波反應。無機固體載體與微波只有弱偶合作用。而固體介質表面上所吸附的有機反應物能充分吸收微波能量，活化后使反應速率大大提高。微波輻射加熱方式不同于傳統(tǒng)的加熱，在極短的時間內，能提供更大的能量，更有利于化學鍵的斷裂。由于反應中不存在因溶劑揮發(fā)而形成高壓、高熱的危險，可在相對安全、溫和的條件下利用普通微波爐在敞口容器中進行，具有安全、高效、操作方便、產物純化容易、裝置簡單等優(yōu)點，避免了大量有機溶劑的使用,對解決環(huán)境污染具有現實意義。

經過多次試驗，得到最佳反應功率為150~200 W。當功率<100 W時，反應物幾乎未見變化；功率>250 W時，由于單位時間的能量過高，反應物會燃燒、碳化，從而導致產率下降。

在體外活性研究中，選用570 nm為MTT法檢測波長，以消除目標化合物自身的顏色對光吸收的干擾。然后以人子宮頸癌SiHa細胞為模型，目標化合物對其進行細胞增殖的抑制活性進行研究，結果表明，目標化合物(3-MO-ILG)對SiHa細胞具有較強抑制增殖作用，濃度在150 μg/mL時其抑制率可達93.5%，而且化合物對癌細胞的增長抑制率顯示出比較強的濃度和時間依賴性，當作用時間達到72 h時，抑制率最強。

為了進一步驗證MTT法的結果，采用流式細胞儀法測定3-甲氧基異甘草素對SiHa細胞的凋亡作用，結果表明3-甲氧基異甘草素在100 μg/mL時，其對SiHa細胞的凋亡率可達40%(早期凋亡率為38.6%，晚期凋亡1.4%)，具有明顯的促進凋亡作用?？傊?，此結果對查爾酮類化合物的結構設計及抗癌藥理作用機制的研究將提供重要的參考依據。

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(本文編輯楊晨晨)

Study on the synthesis of 3-Methoxy isoliquiritigenin and its influence on cervical cancer cells

YANG Xuchao, Shirzat Ablat， Mourboul Ablise，REN Bingzhao

(DepartmentofMedicinalandOrganicChemisty,CollegeofPharmacy,

XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTaking isoliquiritigenin as the lead compounds to synthesize 3-Methoxy isoliquiritigenin, which is the derivatives of isoliquiritigenin, and explore its anticancer activity to human cervical cancer cell in vitro. MethodsThe target compound was prepared by aldol condesation reaction with three methods (catalyzed method on high temperature by boric acid, hydroxyl protected method , microwave-assisted base-catalyzed method). Taking human cervical cancer SiHa as the vitro model， the inhibition rate of SiHa cell was detected by MTT method and the apoptosis of SiHa cell was measured by flow cytometry.Cisplatin was positive control group. ResultsThe yield of the target product was 8.9%, 9.27% and 57.60% respectively by using above three methods. 3-methoxy isoliquiritigenin had a stronger inhibitory effect on SiHa cells. When the drug concentration of 3-MO-ILG was 20-150 μg/mL, and the action time was 24h, the inhibition rate was 93.5%. When the drug concentration of 3-MO-ILG was 100 μg/mL, it had the clear pro-apoptotic effect on Siha cells(the rate of early period apoptotic was 38.6%, and the rate of late apoptotic was 1.4%). ConclusionMicrowave-assisted base-catalyzed method has higher yield on synthesis of chalcones. 3-methoxy isoliquiritigenin had a stronger inhibitory effect and pro-apoptotic effect on SiHa cells and had significant concentration and time dependence.

Keywords:3-Methoxy isoliquiritigenin; aldol condesation reaction; the SiHa cell of human cervircal cancer; antitumor activity

[收稿日期：2015-10-23]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.02.011

中圖分類號：R966

文獻標識碼：A

文章編號：1009-5551(2016)02-0173-06

作者簡介：楊旭超(1991-)，男，碩士，研究方向：天然藥活性成分的藥用研究。通信作者：木合布力·阿布力孜，男(維吾爾族),教授，博士，博士生導師，研究方向：天然藥活性成分的藥用研究，E-mail: mourboul@hotmail.com。

基金項目：國家自然科學基金(81260379); 新疆研究生科研創(chuàng)新項目(XJGRI2014094)