何天文，王奕霞#，郭　浩，袁騰龍，駱明勇，杜　麗，尹愛(ài)華△

(1.廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東廣州 511442；

2.廣東省婦幼代謝與遺傳病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 511442)

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·論著·

胎兒臍帶血血紅蛋白分析在珠蛋白生成障礙性貧血產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值*

何天文1,2，王奕霞1,2#，郭浩1,2，袁騰龍1,2，駱明勇1,2，杜麗1,2，尹愛(ài)華1,2△

(1.廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東廣州 511442；

2.廣東省婦幼代謝與遺傳病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 511442)

摘要:目的探討胎兒臍帶血血紅蛋白分析在珠蛋白生成障礙性貧血(又稱(chēng)地中海貧血)產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法收集夫妻雙方均為相同基因類(lèi)型地中海貧血攜帶者113對(duì)，且女性處于妊娠期，孕24～30周，進(jìn)行產(chǎn)前診斷。應(yīng)用全自動(dòng)毛細(xì)管電泳技術(shù)分析胎兒臍帶血血紅蛋白成分，同時(shí)檢測(cè)胎兒地中海貧血基因。結(jié)果113對(duì)夫妻所孕育的113例胎兒中，11例重型α地中海貧血胎兒臍帶血HbBart′s水平為85.0%～95.5%，9例中間型α地中海貧血胎兒臍帶血HbBart′s達(dá)22.0%～39.5%；6例重型β地中海貧血胎兒臍帶血HbA水平為0%～0.4%，17例輕型β地中海貧血胎兒臍帶血HbA水平為2.1%～12.5%。結(jié)論胎兒臍帶血血紅蛋白分析能快速產(chǎn)前診斷重型α、重型β和中間型α地中海貧血，可作為地中海貧血產(chǎn)前診斷的輔助方法。

關(guān)鍵詞:臍帶血；血紅蛋白分析；珠蛋白生成障礙性貧血；產(chǎn)前診斷

珠蛋白生成障礙性貧血(又稱(chēng)地中海貧血，以下簡(jiǎn)稱(chēng)“地貧”)是一種由于珠蛋白合成障礙導(dǎo)致的遺傳性溶血疾病,主要分為α地中海貧血 (以下簡(jiǎn)稱(chēng)“α地貧”)和β地中海貧血(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“β地貧”)兩種類(lèi)型[1]。地貧是全球分布最廣、累積患病人數(shù)最多的一種單基因遺傳病，中國(guó)主要分布在廣東、廣西和海南等南方地區(qū)，廣東地區(qū)育齡人群地貧基因攜帶率約為16.8%[2]。而重型α地貧一般在妊娠后期發(fā)生胎兒水腫，胎死宮內(nèi)，或在出生的48 h之內(nèi)死亡[3]；中重型β地貧和部分中間型α地貧在出生后3～6個(gè)月出現(xiàn)貧血癥狀，并進(jìn)行性加重，嚴(yán)重者必須依靠輸血維持生命，且多在童年夭折，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)[4]。目前地貧尚無(wú)有效的治療方法，主要通過(guò)對(duì)攜帶相同類(lèi)型地貧基因夫妻進(jìn)行產(chǎn)前診斷防止重型地貧患兒出生。由于不同基因類(lèi)型的地貧胎兒臍帶血血紅蛋白成分和量不同，通過(guò)分析胎兒臍帶血血紅蛋白成分和量可以輔助地貧產(chǎn)前診斷。本文旨在探討胎兒臍帶血血紅蛋白分析在地貧產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料2012年5月至2015年5月于廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心進(jìn)行遺傳咨詢(xún)的113對(duì)夫妻，夫妻雙方均為相同基因類(lèi)型地貧攜帶者，且女性處于妊娠期，孕24～30周。

1.2儀器與試劑主要儀器有法國(guó)Sebia公司Capillarys2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀、eppendorf5810臺(tái)式離心機(jī)和廈門(mén)致善生物有限公司Lab-Aid 820核酸提取儀；血紅蛋白分析檢測(cè)試劑盒及其質(zhì)控品由法國(guó)Sebia公司提供。DNA提取試劑盒由廈門(mén)致善生物有限公司提供。地貧基因檢測(cè)試劑盒由深圳亞能生物科技有限公司提供。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集在超聲波實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)下進(jìn)行胎兒臍靜脈穿刺術(shù)，抽取檸檬酸葡萄糖溶液(ACD)抗凝臍靜脈血1 mL，盡快送檢。

1.3.2臍帶血血紅蛋白毛細(xì)管電泳分析采用法國(guó)Sebia公司生產(chǎn)Capillarys2 全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀及其配套血紅蛋白電泳試劑盒，操作完全按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3胎兒地貧基因檢測(cè)采用Lab-Aid 820核酸提取儀提取臍帶血DNA。α地貧基因檢測(cè):缺失型α地貧采用裂口PCR方法(Gap-PCR) 檢測(cè)，點(diǎn)突變型α地貧和β地貧采用反向斑點(diǎn)雜交PCR(PCR-RDB) 方法檢測(cè)。采用Gap-PCR法檢測(cè)3種缺失型：東南亞缺失(--SEA)、3.7及4．2 缺失(-α3．7、-α4．2);利用反向點(diǎn)雜交(RDB) 技術(shù)檢測(cè)3 種非缺失點(diǎn)突變:CS、QS 和WS點(diǎn)突變(ααCS、ααQS、ααWS)和 17種β地貧：CD41-42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、-28(A>G)、CD71-72(+A)、CD17(A>T)、CD26(G>A)、CD31(-C)、CD27-28(+C)、IVS-Ⅰ-1(G>T)、CD43(G>T)、-32(C>A)、-29(A>G)、-30(T>C)、CD14-15(+G)、Cap+40-43(-AAAC)、起始密碼子突變Initiation condon(T>G)和IVS-Ⅰ-5(G>C)。

2結(jié)果

2.1胎兒地貧基因診斷結(jié)果113例胎兒按地貧基因診斷結(jié)果分為以下幾類(lèi)：未檢測(cè)到地貧基因(正常)26例；重型α地貧11例，中間型α地貧9例，輕型α地貧33例，靜止型α地貧9例；重型β地貧6例，輕型β地貧17例，輕型α合并β地貧及輕型α合并重型β地貧各1例，見(jiàn)表1。

表1　　胎兒地貧基因診斷結(jié)果

-：無(wú)數(shù)據(jù)。

2.2胎兒臍帶血血紅蛋白分析正常和β地貧均以HbA和Hb F為主，除了2例輕型α地貧和4例靜止型α地貧無(wú)HbBart′s之外，α地貧及α地貧合并β地貧胎兒臍帶血均有HbBart′s。見(jiàn)表2。

地貧類(lèi)型n血紅蛋白成分HbAHbFHbBart'sHbpro正常267.60±5.3192.40±5.30--重型α地貧11--90.09±3.049.91±3.04中間型α地貧913.18±2.9563.38±15.3325.74±9.83-輕型α地貧3310.63±4.8485.30±5.814.52±2.35-靜止型α地貧97.38±2.3491.46±2.661.58±2.14-重型β地貧60.07±0.1699.10±1.652.50±2.40-輕型β地貧174.12±2.5395.77±2.49--α合并β地貧22.35±2.4795.75±1.771.9±0.71-

-：無(wú)數(shù)據(jù)。

2.3α地貧胎兒臍帶血血紅蛋白分析胎兒臍帶血HbBart′s水平隨受累α珠蛋白基因個(gè)數(shù)增多而升高，11例重型α地貧胎兒臍帶血HbBart′s為85.0%～95.5%；除1例基因型為--SEA/ααWS胎兒臍帶血HbBart′s為7.5%之外，其余8例中間型α地貧胎兒臍帶血HbBart′s達(dá)22.0%～39.5%；除了2例輕型α地貧無(wú)HbBart′s之外,其余31例輕型α地貧胎兒臍帶血HbBart′s達(dá)1.4%～23.8%；除了4例靜止型α地貧無(wú)HbBart′s之外，其余5例靜止型α地貧胎兒臍帶血Bart′s達(dá)0%～1.3%；正常胎兒臍帶血中沒(méi)檢測(cè)出HbBart′s。

2.4β地貧胎兒臍帶血血紅蛋白分析β地貧均以HbA和HbF為主，β地貧胎兒臍帶血HbA水平隨受累β-珠蛋白基因個(gè)數(shù)的增加而降低，6例重型β地貧胎兒臍帶血HbA為0%～0.4%，17例輕型β地貧胎兒臍帶血HbA水平為2.1%～12.5%。

3討論

人類(lèi)珠蛋白基因的表達(dá)具有時(shí)空順序性，α珠蛋白基因簇和β珠蛋白基因簇的表達(dá)各具特點(diǎn)。α珠蛋白基因簇中的§和ε珠蛋白基因在胚胎卵黃囊中表達(dá)，妊娠10周前完全關(guān)閉，α珠蛋白基因從妊娠第5周開(kāi)始表達(dá)，并持續(xù)至終生；β珠蛋白基因簇中的γ珠蛋白基因也從妊娠第5周開(kāi)始表達(dá)，但在出生前后開(kāi)始關(guān)閉，β珠蛋白基因在胎兒期處于低表達(dá)狀態(tài)，出生前后表達(dá)逐漸增多并持續(xù)至終生[5]。不同發(fā)育階段的人血紅蛋白有其特有的組成，出現(xiàn)各種異常血紅蛋白則可提示其特有的疾病。HbBart′s是由于胎兒時(shí)期α珠蛋白和γ珠蛋白合成不平衡，α珠蛋白合成障礙或不足，過(guò)剩γ珠蛋白自行結(jié)合為γ4的異常血紅蛋白。胎兒期 HbBart′s的出現(xiàn)，提示胎兒存在α地貧，胎兒臍帶血HbBart′s水平隨受累α珠蛋白基因個(gè)數(shù)增多而升高，當(dāng)HbBart′ s≥60%時(shí)，提示為巴氏水腫兒即重型α地貧[6]。本研究中11例重型α地貧胎兒臍帶血HbBart′s水平為85.0%～95.5%；8例中間型α地貧組胎兒臍帶血HbBart′s達(dá)22.0%～39.5%；31例輕型α地貧胎兒臍帶血Hb Bart′s達(dá)1.4%～23.8%；5例靜止型α地貧胎兒臍帶血Hb Bart′s達(dá)0%～1.3%。從本研究結(jié)果看出胎兒臍帶血HbBart′s的定量分析可以在產(chǎn)前快速診斷重型和中間型α地貧。胎兒臍帶血HbBart′s的定量分析相對(duì)檢測(cè)胎兒地貧基

因有著簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、省時(shí)和易于推廣等優(yōu)點(diǎn),結(jié)合家族史可實(shí)現(xiàn)對(duì)妊娠中晚期胎兒α地貧的診斷[7]。

孕周24～28周的胎兒臍帶血中除了有較高水平的HbF，也可檢測(cè)到HbA，分析胎兒臍帶血血紅蛋白電泳的HbA值，可輔助診斷胎兒β地貧[8]。本研究數(shù)據(jù)顯示，β地貧胎兒臍帶血HbA水平隨受累β-珠蛋白基因個(gè)數(shù)的增加而降低，6例重型β地貧胎兒臍帶血HbA水平為0.0%～0.4%，與正常胎兒的HbA水平差異明顯。雖然輕型β地貧胎兒與正常胎兒的HbA水平差異明顯，但是兩者HbA水平有重疊，且交叉2.1%～12.5%。因此胎兒臍帶血HbA水平可以較準(zhǔn)確地診斷出胎兒重型β地貧，但不能有效地檢測(cè)出胎兒輕型β地貧。本研究采用全自動(dòng)毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)胎兒血紅蛋白進(jìn)行分析，全自動(dòng)毛細(xì)管電泳技術(shù)具有精確度高、操作簡(jiǎn)便、時(shí)間短、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠及自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)[9]。HbBart′s的定量分析能快速準(zhǔn)確診斷出重型和中間型α地貧，HbA定量分析能快速準(zhǔn)確診斷出重型β地貧，對(duì)胎兒臍帶血血紅蛋白分析可以作為地貧產(chǎn)前診斷的一種輔助方法，提高胎兒地貧產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性。

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Application value of fetal umbilical cord blood hemoglobin analysis in prenatal diagnosis of thalassemia*

HeTianwen1,2,WangYixia1,2#,GuoHao1,2,YuanTenglong1,2,LuoMingyong1,2,DuLi1,2,YinAihua1,2△

(1.MedicalGeneticsCenter,GuangdongProvincialWomenandChildrenHealthCareHospital,

Guangzhou,Guangdong511442,China;2.MaternalandChildrenMetabolic-GeneticKey

LaboratoryofGuangdongProvince,Guangzhou,Guangdong511442,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the application value of fetal umbilical cord blood hemoglobin analysis in the prenatal diagnosis of thalassemia.Methods113 couples were the carriers of the same gene type of thalassemia,moreover the females were in the pregnant period of 24-30 pregnant weeks and performed the prenatal diagnosis.The fetal umbilical cord blood hemoglobin components were analyzed by the full automatic capillary electrophoresis technique,meanwhile the fetal thalassemia gene was detected.ResultsAmong 113 fetuses,the umbilical cord blood HbBart′s level in 11 cases of severe α thalassemia was 85.0%-95.5%,which in 9 cases of intermediate type α thalassemia was 22.0%-39.5%;the umbilical cord blood HbA level in 6 cases of severe β thalassemia was 0%-0.4%,which in 17 cases of light type β thalassemia was 2.1%-12.5%.ConclusionThe fetal umbilical cord blood hemoglobin analysis could be used for rapid prenatal diagnosis of severe α,β and intermediate type α thalassemia,which can serve as a supplementary method for the prenatal diagnosis of thalassemia.

Key words:umbilical cord blood;hemoglobin analysis;thalassemia;prenatal diagnosis

(收稿日期：2015-09-26)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.03.004

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)03-0297-03

通訊作者△，E-mail：yinaiwa@vip.126.com。

作者簡(jiǎn)介：何天文，男，主管技師，主要從事生化遺傳研究。
`#共同第一作者。

*基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A020212246)。