羅宇鵬

(成都市第五人民醫(yī)院檢驗科，四川成都 611130)

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·論著·

2014年成都某院流感嗜血桿菌的臨床分布及耐藥分析

羅宇鵬

(成都市第五人民醫(yī)院檢驗科，四川成都 611130)

摘要:目的探討該院臨床分離的流感嗜血桿菌分布及抗菌藥物的耐藥情況。方法以該院2014年1～12月所有已篩查合格且培養(yǎng)為陽性的下呼吸道標(biāo)本1 895份、血液類標(biāo)本666份、尿道分泌物標(biāo)本102份，共2 663份標(biāo)本分離出的流感嗜血桿菌438株為研究對象，采用頭孢硝基噻吩紙片測定其β-內(nèi)酰胺酶，用紙片擴散法(K-B法)測定其對8種抗菌藥物的敏感性，利用WHONET5.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果438株流感嗜血桿菌中98.6%來自住院患者，1.4%來自門診；兒童分離株有176株，占40.18%；老年患者分離株194株，占44.29%；下呼吸道標(biāo)本來源434株，占99.09%。對復(fù)方磺胺甲噁唑耐藥率最高，達82.90%，氨芐西林和四環(huán)素的耐藥率分別為43.40%、29.00%；而頭孢呋辛、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、亞胺培南的耐藥率均在2.00%以下。β-內(nèi)酰胺酶的陽性率為43.40%，在氨芐西林耐藥菌株中有1.57%的菌株β-內(nèi)酰胺酶檢測陰性。兒童分離株對氨芐西林的耐藥率和產(chǎn)酶率(42.40%、40.43%)和成人分離菌株對氨芐西林的耐藥率及產(chǎn)酶率(44.00%、44.00%)沒有明顯差異。結(jié)論流感嗜血桿菌主要分離自下呼吸道標(biāo)本中；以兒童和老年患者為主，第二、三代頭孢菌素類與阿奇霉素可作為臨床首選藥物，β-內(nèi)酰胺酶是該菌對氨芐西林耐藥的主要機制。

關(guān)鍵詞:流感嗜血桿菌；耐藥性；抗菌藥物；β-內(nèi)酰胺酶

流感嗜血桿菌一般存在于人類的上呼吸道中，只侵犯人類的革蘭陰性苛養(yǎng)細(xì)小細(xì)菌，也是社區(qū)獲得性肺病(CAP)、慢性支氣管炎急性發(fā)作(AECG)的常見病原菌之一，可侵入血液、腦脊液及皮膚黏膜等引起敗血癥、腦膜炎、肺炎、膿毒關(guān)節(jié)炎等[1-2]。近年來，由于抗菌藥物的不合理使用，流感嗜血桿菌的耐藥率不斷上升，為了解本院流感嗜血桿菌對抗菌藥物的耐藥率，指導(dǎo)臨床合理用藥，對本院2014年全年所有培養(yǎng)標(biāo)本分離出的流感嗜血桿菌進行分離鑒定、β-內(nèi)酰胺酶檢測及紙片擴散法(K-B)法藥敏試驗，并進行耐藥性分析。

1資料與方法

1.1一般資料收集2014年全年本院門診及住院患者所有已篩查合格且培養(yǎng)為陽性的下呼吸道標(biāo)本1 895份、血液類標(biāo)本666份、尿道分泌物標(biāo)本102份，共2 663份標(biāo)本分離出流感嗜血桿菌438株；考慮到流感嗜血桿菌的致病性及分離檢出率，其他常見臨床標(biāo)本如咽拭子、灌洗液、腦脊液等未納入統(tǒng)計。

1.2儀器與試劑哥倫比亞血瓊脂、麥康凱、巧克力培養(yǎng)基(含萬古霉素)、HTM藥敏培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基、革蘭染液均由成都瑞琦生物有限公司提供；胰蛋白消化酶粉由上海源聚生物科技公司提供；普通孵育箱、二氧化碳孵育箱、BD FX400血培養(yǎng)儀Olympus CX31顯微鏡、游標(biāo)卡尺等。復(fù)方磺胺甲噁唑(SXT)、氨芐西林(AMP)、環(huán)丙沙星(CIP)、頭孢曲松(CRO)、頭孢呋辛(CXM)、阿奇霉素(AZM)、四環(huán)素(TCY)、亞胺培南(IPM)、V因子、X因子、(V+X)因子及β-內(nèi)酰胺酶藥敏紙片均購自英國OXOID公司；質(zhì)控菌株為流感嗜血桿菌ATCC49247、流感嗜血桿菌ATCC49766(補充ATCC49247不能涵蓋的藥敏質(zhì)控)、金黃色葡萄球菌ATCC25923。

1.3方法

1.3.1下呼吸道標(biāo)本(1)下呼吸道標(biāo)本的采集。漱口，深呼吸咳深部痰液于無菌杯送檢；晨痰最佳。(2)下呼吸道標(biāo)本的篩查。直接或通過洗滌后達到顯微鏡鏡下白細(xì)胞數(shù)目不低于25個/高倍鏡，上皮細(xì)胞不高于10個/低倍鏡視為合格標(biāo)本，進一步洗滌勻質(zhì)化；若鏡下白細(xì)胞數(shù)目小于25個/高倍鏡，視為不合格標(biāo)本[3]。(3)下呼吸道標(biāo)本的洗滌、涂片、勻質(zhì)化及接種孵育。對于合格的痰液標(biāo)本，加入適量的生理鹽水進行洗滌，挑取膿性痰液部分進行涂片染色鏡檢，同時加入胰蛋白酶粉(濃度為1%)35 ℃進行勻質(zhì)化60～90 min后，分區(qū)劃線接種哥倫比亞血瓊脂、麥康凱、巧克力培養(yǎng)基，麥康凱培養(yǎng)基放置普通孵育箱孵育(35 ℃，18～24 h)，哥倫比亞血瓊脂及巧克力培養(yǎng)基放置CO2孵育箱孵育(35 ℃ 5%CO218～24 h)。

1.3.2血液類標(biāo)本標(biāo)本采集由臨床護士完成，直接采集8～10 mL血液注入成人血培養(yǎng)瓶，放置BD FX400血培養(yǎng)儀直接孵育，陽性報警則涂片接種培養(yǎng)基。

1.3.3尿道分泌物標(biāo)本(1)尿道分泌物的采集。由皮膚科醫(yī)生或外科醫(yī)生采用專用尿道拭子伸入尿道3～4 cm處，停留5 s，再旋轉(zhuǎn)退出，放入無菌管內(nèi)。(2)尿道分泌物的篩查。加入適量生理鹽水潤濕，涂片染色鏡檢；鏡檢標(biāo)準(zhǔn)及接種培養(yǎng)基同灌洗液。

1.3.4致病菌與定植菌(或污染菌)的區(qū)分(1)下呼吸道、咽拭子、灌洗液及尿道分泌物等標(biāo)本。膿細(xì)胞內(nèi)涂片查見革蘭陰性細(xì)小短桿菌，視為致病菌；未查見則視為定植菌。(2)血液及腦脊液標(biāo)本。涂片查見革蘭陰性細(xì)小短桿菌，視為致病菌。

1.3.5細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基不生長或生長細(xì)小，麥康凱培養(yǎng)基不生長，巧克力培養(yǎng)基生長，革蘭染色為革蘭陰性細(xì)小或呈扭曲之長絲狀；在巧克力培養(yǎng)基上菌落灰色/無色、半透明、露滴樣菌落，0.6～2.0 mm為流感嗜血桿菌；挑取可疑菌落做成0.5麥?zhǔn)暇簼岫?，再按要求接種于腦心浸液培養(yǎng)基和哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，分別點種金黃色葡萄球菌進行衛(wèi)星試驗，在腦心浸液培養(yǎng)基上貼上V因子、X因子及(V+X)因子3種生長因子，35 ℃孵育24 h，如哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上衛(wèi)星試驗陽性且不溶血的菌落、腦心浸液培養(yǎng)基上衛(wèi)星試驗陰性、(V+X)因子陽性、V因子和X因子陰性則鑒定為流感嗜血桿菌。

1.3.6藥敏試驗采用K-B法分別進行SXT、AMP、CIP、CRO、TCY、CXM、IPM、AZM等8種抗菌藥物的敏感性測定，按照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2014版的判定標(biāo)準(zhǔn)測量抑菌環(huán)直徑，以及判定耐藥及敏感性。

1.3.7質(zhì)控采用流感嗜血桿菌ATCC49247及ATCC49766進行藥敏試驗質(zhì)控，采用流感嗜血桿菌ATCC49247及金黃色葡萄球菌ATCC25923進行因子紙片、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基及巧克力培養(yǎng)基質(zhì)控。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用WHONET 5.6進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果

2.1流感嗜血桿菌分布情況在438株流感嗜血桿菌中，98.6%來自住院患者，1.4%來自門診；科室的分布中兒科最高37.67%，其次為內(nèi)科37.21%，重癥監(jiān)護室5.94%，外科3.88%，血液腫瘤科2.28%，感染科1.37%，其他科室11.64%；年齡10歲以下占40.18%，10～<20歲占0.68%，20～<30歲占0.68%，30～<40歲占1.14%，40～<50歲占3.65%，50～<60歲占9.36%，60歲及以上占44.29%。標(biāo)本類型以下呼吸道標(biāo)本分離菌株最多，為434株，血液標(biāo)本中分離2株，尿道分泌物標(biāo)本中分離2株。見表1。

表1　　438流感嗜血桿菌標(biāo)本來源、科室分布及

2.2藥敏試驗438株分離菌株中共檢測出190株(43.40%)產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌，在氨芐西林耐藥菌株中有3株(1.57%)未檢測出β-內(nèi)酰胺酶，438株流感嗜血桿菌對各種抗菌藥物的敏感性見表2(見《國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

3討論

流感嗜血桿菌是條件感染性致病菌，正常情況下存在于人的上呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道，不引起任何感染，但在適當(dāng)條件下，如病毒感染或免疫力下降則會侵入呼吸道黏膜、血液及腦脊液引起感染而出現(xiàn)臨床癥狀。與本院2014年所分離到的流感嗜血桿菌來自下呼吸道標(biāo)本、血液及尿道分泌物標(biāo)本中的結(jié)果相符。

流感嗜血桿菌是CAP、AECG常見致病菌之一，但在本研究中檢出該菌的患者主要以住院患者為主，占98.6%，而門診患者卻很少，可能的原因是流感嗜血桿菌耐藥率低，門診患者自己經(jīng)驗性濫用抗菌藥物或臨床醫(yī)生經(jīng)驗性使用抗菌藥物過多有關(guān)，從而造成門診陽性率偏低；但這從另一方面反映了在抗菌藥物使用前采集合格的標(biāo)本及合理使用抗菌藥物的重要性；本研究中檢測的438株流感嗜血感染主要來自兒童(占40.18%)及老年患者(占44.29%)，老年患者所占比例略高于兒童患者。以上結(jié)果很好地證明了流感嗜血桿菌是CAP、AECG常見致病菌之一，且由于兒童及老年患者的抵抗力較弱，所以感染率相對較高，與中國大部分地區(qū)相似[1-4]。

在體外藥敏試驗中，對流感嗜血桿菌耐藥率最高的為復(fù)方磺胺甲噁唑，達82.90%，且兒童組(88.80%)的耐藥率要高于成人組(79.40%)；其次為氨芐西林，占43.40%，兒童組(42.40%)和成人組(44.40%)差別不大。青霉素類抗菌藥物原為治療流感嗜血桿菌的首選藥物，但是由于臨床抗菌藥物的不合理使用，從而導(dǎo)致耐氨芐西林的耐藥株不斷增加，給診斷和治療帶來了一定的困難，所以本地區(qū)現(xiàn)不宜用氨芐西林和復(fù)方磺胺甲噁唑作為流感嗜血桿菌感染的經(jīng)驗性用藥。而其他的抗菌藥物，如頭孢呋辛、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、亞胺培南的耐藥率均較低，對于流感嗜血桿菌感染，上述藥物均有很好的抗菌活性，可以適當(dāng)選擇，但喹諾酮類藥物會影響兒童軟骨發(fā)育，且由于有很強的誘導(dǎo)耐藥性，一般不推薦用于18歲以下患者。

流感嗜血桿菌的耐藥性主要是由于β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生、青霉素結(jié)合蛋白的改變，以及細(xì)胞膜對抗菌劑通透性的改變所引起。流感嗜血桿菌對氨芐西林的耐藥于1972年首先在歐洲報道，主要耐藥機制是產(chǎn)生質(zhì)粒介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶，有90%以上為TCYM-1型基因，少數(shù)為ROB-1型基因[5]，β-內(nèi)酰胺酶可滅活氨基青霉素、羧基青霉素和脲基青霉素。在氨芐西林耐藥菌株中，有3株未檢測出β-內(nèi)酰胺酶，本試驗中β-內(nèi)酰胺酶的檢出率為1.57%，與國外報告的β-內(nèi)酰胺酶陰性菌的氨芐西林耐藥率接近[6]，耐藥性通常是由于一種或多種青霉素結(jié)合蛋白的改變和外膜蛋白通透性下降所引起，且影響所有的β-內(nèi)酰胺酶類藥物，但各菌株的耐藥水平有差異。這些菌株所致感染的臨床治療結(jié)果不確定，其耐藥機制有待進一步研究[7-8]。

綜上所述，流感嗜血桿菌對氨芐西林的耐藥率有增高趨勢，在用藥過程中應(yīng)進行細(xì)菌培養(yǎng)，及時調(diào)整抗菌藥物，微生物室應(yīng)通知臨床醫(yī)生合理使用抗菌藥物，應(yīng)重視和加強流感嗜血桿菌的培養(yǎng)及耐藥性監(jiān)測工作，特別對于兒童和老年患者，進行細(xì)菌培養(yǎng)對提高其患者治愈率，延緩細(xì)菌耐藥性具有非常重要的意義。

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Clinical distribution of Hemophilus influenzae and its drug resistance analysis

LuoYupeng

(DepartmentofClinicalLaboratory,ChengduMunicipalFifthPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan611130,China)

Abstract:ObjectiveTo study the distribution of clinically separated Hemophilus (H.) influenzae and its drug resistance situation.MethodsAmong 2 663 specimens of screening qualified and positive culture collected from the outpatients,inpatients and emergency patients of our hospital from January to December 2014,including 1 895 specimens of lower respiratory tract,666 blood specimens and 102 urinary secretion specimens,438 strains of H.influenzae were isolated.The cephalosporin nitro thiophene paper test strip was used to test its beta lactamase and the K-B method was used to detect its sensitivity to 8 kinds of antibacterial drugs.The testing data were statistically analyzed by using WHONET5.6 software.ResultsAmong 438 strains of H.influenzae,98.6% was originated from hospitalized patients,1.4% from the outpatient department;176 isolated strains were originated from children,accounting for 40.18%;194 strains (44.29%) were from elderly patients,434 strains(99.09%) were originated from the lower respiratory tract specimens.The resistance rate to compound sulfamethoxazole was highest and reached 82.90%,which to ampicillin and tetracycline were 29.00% and 43.40% respectively;but which to cefuroxime,ceftriaxone,ciprofloxacin,azithromycin,imipenem were below 2.00%.The β-lactamase positive rate was 43.40%,in ampicillin resistant strains,1.57% of strain was negative in β-lactamase test.The resistance to ampicillin and enzyme production rate had no significant differences between the children isolated strains and adult isolated strains (42.43%,42.40%vs. 44.00%,44.00%).ConclusionH.influenzae is mainly isolated from lower respiratory tract specimens;which is dominated by children and elderly patients;the second and third generations of cephalosporins and azithromycin can serve as a clinical preferred drugs;β-lactamase is the primary mechanism of resistance to ampicillin.

Key words:Hemophilas influenzae;drug resistance;antibacterial agents;β-lactamase

(收稿日期：2015-06-02)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.03.018

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)03-0333-03

作者簡介：羅宇鵬，男，主管檢驗技師，主要從事臨床微生物檢驗研究。