桂瑞豐，胡文輝

(1.黃岡市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 黃岡　438000；

2.鄂州市中心血站質(zhì)量管理科，湖北 鄂州　436000)

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miRNA在肝癌患者血清中的表達(dá)及意義

桂瑞豐1，胡文輝2

(1.黃岡市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 黃岡438000；

2.鄂州市中心血站質(zhì)量管理科，湖北 鄂州436000)

摘要：目的探討肝細(xì)胞性肝癌(HCC)患者血清中miR-27a、miR-30a、miR-106b、miR-490這四種miRNAs的表達(dá)變化及臨床意義。方法選取50例肝癌患者為研究組、50例慢性肝病患者及50例健康體檢者為對(duì)照組，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組血清四種miRNAs表達(dá)水平，并比較其與患者臨床病理特征之間的關(guān)系，應(yīng)用受試者回歸(ROC)曲線(xiàn)分析miRNA對(duì)于肝癌診斷的價(jià)值。結(jié)果血清miR-27a、miR-30a、miR-490在HCC患者、慢性肝病患者及健康對(duì)照中表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)，HCC患者血清miR-106b表達(dá)水平較正常對(duì)照組及慢性肝病組均顯著升高(P<0.05)；血清miR-106b表達(dá)水平在不同腫瘤分化程度及臨床分期有顯著差異(P<0.05)；ROC曲線(xiàn)分析顯示血清miR-106b區(qū)分肝癌與慢性肝病及正常人的臨界值為0.038，曲線(xiàn)下面積( AUC)為0.782，診斷敏感度為0.82，特異度為0.75。結(jié)論miR-106b在肝癌患者血清中表達(dá)升高顯著，可作為肝癌診斷與預(yù)后評(píng)估的有效指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞性肝癌；miRNA；血清水平

細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也為肝臟最主要的惡性腫瘤，在所有癌癥中死亡率排名第三[1]。肝癌的早期癥狀不明顯，大多數(shù)肝癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，且其復(fù)發(fā)率較高，手術(shù)后極易復(fù)發(fā)，故肝癌患者的總體5年生存率極低[2]。近年來(lái)對(duì)于肝癌診斷的特異性標(biāo)志物的研究一直是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一，微小RNA(microRNAs, miRNAs)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展的密切關(guān)系已被證實(shí)，其正在成為腫瘤標(biāo)志物研究的新熱點(diǎn)[3]?，F(xiàn)有的研究表明miR-27a、miR-30a、miR-106b與miR-490與惡性腫瘤高度相關(guān)，miR-27a與miR-30a異常表達(dá)在食管癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤中[4-6]，miR-106b與miR-490在肝癌患者組織或細(xì)胞中表達(dá)異常，并與肝癌的病理學(xué)特征具有一定關(guān)系[7-8]，為了了解這四種miRNAs在HCC患者血清中的表達(dá)水平，并分析它們的在臨床應(yīng)用的實(shí)際意義，報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取2014年2—12月來(lái)黃岡市中心醫(yī)院初診的50例肝癌患者為研究組，年齡25～67歲，平均年齡(51.4±12.8)歲，男32例，女18例，入組標(biāo)準(zhǔn)：知情同意，首次確診為HCC，未接受任何手術(shù)、化療、放療治療，并排除既往有腫瘤病史患者；選取同期來(lái)我院就診的50例慢性乙肝或慢性乙肝所致肝硬化患者為慢性肝病對(duì)照組，其中男35例，女15例，年齡(54.3±11.7)歲；選取同期來(lái)我院體檢中心進(jìn)行健康體檢的健康成年人為健康對(duì)照組，其中男34例，女16例，年齡(52.7±12.4)歲，各組的一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Real-Time PCR(SYBR Green)試劑盒均購(gòu)自上海羅氏公司，miR-27a、miR-30a、miR-106b、miR-490及內(nèi)參miR-16引物均由上海生工設(shè)計(jì)合成。熒光定量PCR儀為美國(guó)Applied Biosystems公司 ABI 7500 Real time PCR儀。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1血清標(biāo)本的采集與保存采集患者及健康對(duì)照靜脈血標(biāo)本3～5 mL，排除黃疸、脂濁及溶血標(biāo)本，常溫靜置30 min，待其充分凝結(jié)析出血清后4℃下3 000 r·min-1離心20 min，吸出上清液4℃下16 000 r·min-1離心10 min，小心吸取上清血清放入無(wú)RNA酶的1.5 mL EP管中-80℃超低溫冰箱保存。

1.3.2總RNA的提取將血清標(biāo)本于超低溫冰箱中取出并迅速置于37℃水浴中解凍，取200 μL血清按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，與RNA保存液置于無(wú)RNA酶的1 mL EP管中，立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR。

1.3.3逆轉(zhuǎn)錄PCR按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，由于miRNA分子較短，故選用加尾法逆轉(zhuǎn)錄，并在無(wú)RNA酶的PCR管中進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將獲得的cDNA分裝保存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.3.4熒光定量PCR按照Real-Time PCR(SYBR Green)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件95℃15 s，55℃30 s，70℃34 s，共40循環(huán)，并于70℃時(shí)采集熒光信號(hào)，反應(yīng)重復(fù)三次取平均值為最終結(jié)果。

1.3.5結(jié)果判定記錄反應(yīng)Ct值，以miR-16為定量參照，以2-△Ct表示各miRNA的相對(duì)表達(dá)，△Ct= CtmiRNA-CtmiR-16。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，miRNA的相對(duì)表達(dá)量用中位數(shù)(四分位數(shù))表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。此外，受試者回歸曲線(xiàn)(Receiver operating characteristics，ROC)分析使用SAS 6.12軟件進(jìn)行。顯著性水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1miRNAs的表達(dá)情況熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增曲線(xiàn)見(jiàn)圖1，研究組、慢性肝病對(duì)照組及健康對(duì)照組的各miRNA相對(duì)表達(dá)情況見(jiàn)表1。miR-27a、miR-30a與miR-490的相對(duì)表達(dá)量各組間無(wú)顯著差異(P>0.05)，研究組miR-106b相對(duì)表達(dá)量顯著大于健康對(duì)照組(P<0.05)，而慢性肝病對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2HCC患者血清miRNA表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系HCC患者的miR-27a、miR-30a與miR-490的血清相對(duì)表達(dá)量在患者性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度以及TNM分期中的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-106b在HCC患者臨床病理特征中的不同表達(dá)見(jiàn)表2，miR-106b在年齡、性別、腫瘤直徑上表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)，腫瘤細(xì)胞分化程度低的患者的血清miR-106b相對(duì)表達(dá)明顯高于分化程度高、中的患者(P<0.05)，TNM分期Ⅲ/Ⅳ的患者的血清miR-106b相對(duì)表達(dá)明顯高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05)。

圖1　部分樣本的熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增曲線(xiàn)

miRNA研究組慢性肝病對(duì)照組健康對(duì)照組miR-27a1.362(0.967,1.758)1.181(0.875,1.363)1.056(0.789,1.341)miR-30a0.742(0.647,0.975)0.841(0.712,0.983)0.973(0.773,1.148)miR-106b0.051(0.034,0.091)*0.024(0.015,0.043)0.021(0.012,0.041)miR-4900.062(0.047,0.081)0.071(0.052,0.085)0.074(0.057,0.088)

注：與健康對(duì)照相比，*P<0.05。

表2　 miR-106b的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3血清miR-106b的診斷價(jià)值用血清miR-106b的相對(duì)表達(dá)作為標(biāo)志物用于區(qū)分HCC患者與慢性肝病患者及健康對(duì)照，綜合特異度與靈敏度選擇兩者之和最大截?cái)帱c(diǎn)(Cut-off)為臨界值，結(jié)果表明：臨界值為0.038，敏感度為0.82，特異度為0.75，曲線(xiàn)下面積(Area under curve，AUC)為0.782(95%CI：0.658～0.871，P<0.01)。用該臨界值對(duì)慢性肝病患者及HCC患者進(jìn)行鑒別診斷的結(jié)果見(jiàn)表3，敏感度為0.80，特異度為0.72。

表3　血清miR-106b對(duì)HCC的診斷結(jié)果/例

3討論

miRNA是一類(lèi)內(nèi)源性的小分子非編碼RNA，具有高度的穩(wěn)定性，在mRNA 水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，參與調(diào)控有機(jī)體的生命活動(dòng)并在細(xì)胞各項(xiàng)正常生命活動(dòng)及包括腫瘤在內(nèi)的各種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，近年來(lái)由于其與癌癥等疾病的良好關(guān)聯(lián)性，使其成為對(duì)各類(lèi)癌癥具有潛在臨床診療價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物的新選擇[9]。本研究根據(jù)這一原理，分析了4個(gè)miRNAs在HCC患者、慢性肝病患者和健康人對(duì)照血清中的表達(dá)，研究這幾種miRNAs與HCC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系以及對(duì) HCC 的診斷價(jià)值。

miR-27a與miR-30a已被證實(shí)與前列腺癌、乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤密切相關(guān)。在乳腺癌，miR-27a通過(guò)間接促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的存活素的表達(dá)來(lái)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，miR-27a在乳腺浸潤(rùn)性癌中高表達(dá)，且高表達(dá)miR-27a的乳腺癌患者預(yù)后較差，5年生存率較低[10]。在前列腺癌中，miR-30a可通過(guò)影響肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子與EGF(表皮生長(zhǎng)因子)等致癌因子的表達(dá)來(lái)抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，發(fā)揮抑制腫瘤的作用[11]。而在本研究中，miR-27a與miR-30a在HCC患者、慢性肝病患者及健康對(duì)照血清中表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)，它們?cè)贖CC發(fā)生發(fā)展中的意義尚待進(jìn)一步大樣本的研究考證。miR-490被認(rèn)為可能為一種抑癌基因，并在結(jié)直腸癌、膀胱癌等惡性腫瘤中低表達(dá)[12]，但在肝癌患者組織中表達(dá)上調(diào)[8]，但本研究在HCC患者、慢性肝病患者及健康對(duì)照血清中未發(fā)現(xiàn)miR-490的表達(dá)差異(P>0.05)，其與HCC的關(guān)系尚待進(jìn)一步研究。

miR-106b是miR-106b～25簇的組成部分，位于人第7號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，miR-106b與腫瘤的密切聯(lián)系已在多種腫瘤中被證實(shí)，其表達(dá)的升高與腫瘤的惡性程度正相關(guān)，如前列腺癌、胃癌等[13-14]。在肝癌中，miR-106b被證實(shí)在肝癌組織中表達(dá)升高，并且在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中顯著升高[7]。在本研究中，血清miR-106b的表達(dá)水平在HCC患者中較慢性肝病與健康對(duì)照顯著升高，且HCC患者的miR-106b血清表達(dá)水平在不同腫瘤細(xì)胞分化程度、TNM分期顯著不同，腫瘤細(xì)胞分化程度低的患者的血清miR-106b相對(duì)表達(dá)明顯高于分化程度高、中的患者(P<0.05)，TNM分期Ⅲ/Ⅳ的患者的血清miR-106b相對(duì)表達(dá)明顯高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05)，提示miR-106b在鑒別HCC患者的臨床病理參數(shù)、腫瘤惡性程度及術(shù)前病情評(píng)估上有廣闊的應(yīng)用前景。

在用miR-106b作為標(biāo)志物對(duì)HCC患者、慢性肝病患者及健康對(duì)照進(jìn)行診斷的研究中，ROC曲線(xiàn)分析顯示，最佳臨界值為0.038，敏感度為0.82，特異度為0.75，具有較高的診斷價(jià)值，且其在對(duì)區(qū)分慢性肝病與HCC上仍有較高的敏感度與特異度，提示其對(duì)肝癌早期診斷有著潛在的篩查價(jià)值，可用于對(duì)慢性肝炎及肝硬化患者等肝癌高危人群的篩查診斷。

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本刊法定計(jì)量單位實(shí)行國(guó)務(wù)院1984年2月頒布的《中華人民共和國(guó)法定計(jì)量單位》，并以單位符號(hào)表示，具體使用參照1991年中華醫(yī)學(xué)會(huì)編輯出版部編輯的《法定計(jì)量單位在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用》一書(shū)。注意單位名稱(chēng)與單位符號(hào)不可混合使用，如ng·kg-1·天-1應(yīng)改為ng·kg-1·min-1；組合單位符號(hào)中表示相除的斜線(xiàn)多于1條時(shí)，應(yīng)采用負(fù)數(shù)冪的形式表示，如ng/kg/min應(yīng)采用ng·kg-1·min-1的形式；組合單位中斜線(xiàn)和負(fù)數(shù)冪亦不可混用，如前例不宜采用ng/kg·min-1的形式。在首次出現(xiàn)不常用的法定計(jì)量單位處用括號(hào)加注與舊制單位的換算系數(shù)，下文再出現(xiàn)時(shí)只列法定計(jì)量單位。人體及動(dòng)物體內(nèi)的壓力單位使用mmHg或cmH2O,但文中首次出現(xiàn)時(shí)用括號(hào)加注(1 mmHg=0.133 kPa)。正文中時(shí)間的表達(dá)，凡前面帶有具體數(shù)據(jù)者應(yīng)采用d、h、min、s，而不用天、小時(shí)、分鐘、秒。量的符號(hào)一律用斜體字母，如吸光度(舊稱(chēng)光密度)的符號(hào)為A,“A”為斜體字。

收稿日期：(2015-09-20，修回日期：2015-11-17)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.037