李雙姝，劉純成，李兵兵，劉晗，朱葉飛

(1.南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.淮安市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 淮安 223001；3.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，江蘇 南京 210011)

淮安市2013-2015年致瀉大腸埃希氏菌的檢測(cè)和流行特征分析

李雙姝1，2，劉純成2，李兵兵2，劉晗2，朱葉飛1，3

(1.南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.淮安市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 淮安 223001；3.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，江蘇 南京 210011)

目的 了解2013-2015年淮安市致瀉大腸埃希氏菌的檢出情況和流行特征，為疾病的防治提供依據(jù)。方法于2013-2015年從淮安市各哨點(diǎn)醫(yī)院和社區(qū)醫(yī)院腹瀉門(mén)診患者的795份糞便標(biāo)本中分離大腸埃希氏菌，使用多重PCR方法篩查致瀉大腸埃希氏菌，再結(jié)合生化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果在795份腹瀉標(biāo)本中共檢出致瀉大腸埃希氏菌80株，檢出率為10.06%。其中ETEC 34株，檢出最高，其余依次為EAEC 18株、EPEC 16株、EIEC 7株和EHEC 5株。按季節(jié)分布統(tǒng)計(jì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，夏秋兩季為主要流行時(shí)段。城市和農(nóng)村的地域分布則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；從人群分布分析，不同性別陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但不同年齡組之間比較則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論淮安市致瀉大腸埃希氏菌主要流行型別為ETEC，夏秋兩季為主要流行時(shí)段，≤5歲和6～18歲為易感人群，今后應(yīng)加強(qiáng)對(duì)重點(diǎn)時(shí)段和人群的監(jiān)測(cè)。

淮安；腹瀉；致瀉大腸埃希氏菌；流行特征

致瀉大腸埃希氏菌(diarrheogenic Escherichia coli，DEC)是引發(fā)感染性腹瀉疾病的重要病原菌之一，依其致病機(jī)制、臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)特征和血清學(xué)分型，可分為5類[1]：腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌(ETEC)、腸聚集性大腸埃希菌(EAEC)、腸致病性大腸埃希菌(EPEC)、腸侵襲性大腸埃希菌(EIEC)和腸出血性大腸埃希菌(EHEC)[2]。隨著PCR檢測(cè)技術(shù)的不斷改善，PCR檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)在DEC檢測(cè)中廣泛應(yīng)用，DEC檢測(cè)的準(zhǔn)確率和檢出率都有很大提高[3]。

為了解淮安市腹瀉標(biāo)本中致瀉大腸埃希氏菌的流行狀況，筆者于2013年3月至2015年12月從淮安市各哨點(diǎn)醫(yī)院和社區(qū)醫(yī)院采集腹瀉患者糞便標(biāo)本795份，開(kāi)展了目標(biāo)菌的分離、鑒定和分型檢測(cè)，并對(duì)其流行病學(xué)特征進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 于2013-2015年收集哨點(diǎn)醫(yī)院(淮安市第一人民醫(yī)院，淮安市第二人民醫(yī)院，淮安市清河區(qū)社區(qū)醫(yī)院)腹瀉門(mén)診病例服用抗生素前的糞便標(biāo)本，置于Cary-Blair培養(yǎng)基，24 h內(nèi)低溫送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。其中腹瀉病例定義為24 h內(nèi)大便次數(shù)≥3次、大便性狀有改變(呈稀便、水樣便或膿血便等)的門(mén)診患者。

1.2 儀器與試劑 實(shí)驗(yàn)所用Cary-Blair培養(yǎng)基、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂均購(gòu)自北京陸橋生物制品有限公司；診斷血清購(gòu)自蘭州生物制品研究所；ABT五種致瀉性大腸埃希氏菌多重檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京ABT公司；API 32E試劑條購(gòu)自梅里埃公司，VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀及GN鑒定卡購(gòu)自bioMerieux公司；瓊脂糖購(gòu)于西班牙Biowest公司；普通PCR和凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.3.1 病原分離與鑒定 采樣拭子直接劃線接種大腸桿菌顯色培養(yǎng)基，篩選出藍(lán)色、突起、光滑、濕潤(rùn)的可疑菌落，轉(zhuǎn)種營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)后分別作鑒定。

1.3.2 多重PCR 本實(shí)驗(yàn)使用北京ABT公司生產(chǎn)的五種致瀉大腸多重檢測(cè)PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，該試劑盒可以對(duì)bfpB、escV、stx1、stx2、elt、estIa、estIb、invE、astA、aggR、pic 11種毒力基因進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃4 min；變性95℃30 s，復(fù)性62℃30 s，延伸72℃90 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，選用濃度為2%的瓊脂糖凝膠，應(yīng)用Bio-RAD平板電泳儀進(jìn)行電泳，電壓設(shè)置為92 V，時(shí)間50 min，選用條帶大小間隔100 bp DNAMarker進(jìn)行對(duì)照，見(jiàn)圖1。

1.3.3 5種DEC的判定標(biāo)準(zhǔn) 所有DEC均有一條uidA擴(kuò)增條帶，在uidA條帶基礎(chǔ)上，若有毒力基因條帶的擴(kuò)增，根據(jù)基因種類的組合判斷為何種致瀉大腸埃希氏菌，見(jiàn)表1。

表1 5種致瀉大腸埃希氏菌陽(yáng)性判定毒力基因組合

圖1 致瀉大腸埃希氏菌多重PCR電泳圖譜

1.3.4 生化鑒定 采用API 32E試劑條對(duì)PCR陽(yáng)性菌株進(jìn)行生化鑒定。

1.3.5 血清鑒定 采用相應(yīng)致瀉大腸血清的O多價(jià)、單價(jià)和H診斷血清進(jìn)行血清凝集試驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)數(shù)據(jù)分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 致瀉大腸埃希氏菌檢出情況 795份樣品中檢測(cè)出致瀉大腸埃希氏菌80株，檢出率為10.06%。其中ETEC檢出數(shù)量最多為34株，占所有檢出DEC的42.00%，其次是EAEC 18株、EPEC 16株、EIEC 7株和EHEC 5株，分別占檢出DEC的22.50%、20.00%、8.75%和6.25%，可見(jiàn)，ETEC是淮安市致瀉大腸埃希氏菌的主要感染類型，其次為EAEC和EPEC。5種致瀉大腸埃希氏菌詳細(xì)分布表2。

表2 淮安市2013-2015年5種致瀉大腸埃希氏菌分布(株)

2.2 不同季節(jié)分布情況 按季節(jié)分布分析，淮安市致瀉大腸埃希氏菌的檢出主要集中在8、9、10三個(gè)月，這符合細(xì)菌感染多發(fā)生在夏、秋兩季的特性?；窗彩兄聻a大腸埃希氏菌所致腹瀉各季節(jié)發(fā)病率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.774，P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表3 淮安市2013-2015年致瀉大腸埃希氏菌監(jiān)測(cè)結(jié)果季節(jié)分布

2.3 不同人群和地域分布情況 淮安市致瀉大腸埃希氏菌的發(fā)病率從性別上分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；在年齡上，不同年齡組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中≤5年齡組和6～18年齡組是淮安市致瀉大腸埃希氏菌主要發(fā)病人群；城市和鄉(xiāng)村的發(fā)病率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表4。

表4 淮安市2013-2015年致瀉大腸埃希氏菌監(jiān)測(cè)結(jié)果人群分布

3 討 論

致瀉大腸埃希氏菌是引起感染性腹瀉的主要病原菌。有研究表明，致瀉大腸埃希氏菌感染在細(xì)菌性感染腹瀉中居首位[4]。致瀉大腸埃希氏菌血清型眾多，交叉凝結(jié)現(xiàn)象明顯，本文運(yùn)用多重PCR毒力篩查、結(jié)合生化鑒定驗(yàn)證的方法進(jìn)行檢測(cè)，提高了陽(yáng)性檢出率，減少了錯(cuò)診、誤診[3]。

我國(guó)DEC感染類型主要以EPEC和ETEC為主，從各地DEC監(jiān)測(cè)結(jié)果看，北京地區(qū)2014年DEC檢出率為4.00%，感染類型以EPEC和ETEC為主[5]；江蘇泰州2013年檢出率為10.23%，EPEC為主要感染類型[6]；貴陽(yáng)2010年檢出率高達(dá)34.65%，EAEC為主要感染類型[7]；沈陽(yáng)地區(qū)2012-2014年DEC檢出率為6.65%，EAEC為主要感染類型[8]；福建省2010-2012年檢出率為6.65%，EPEC為主要感染類型[9]。不同地區(qū)DEC的檢出率與優(yōu)勢(shì)菌群各不相同[10]。

淮安市在2013-2015年于795份腹瀉標(biāo)本中共檢出DEC 80株，檢出率達(dá)10.06%，與泰州檢出率相當(dāng)，高于北京、沈陽(yáng)等地區(qū)，低于貴陽(yáng)。貴陽(yáng)地區(qū)在檢測(cè)方法上采用的熒光PCR方法[7]，而其他地區(qū)[11]的檢測(cè)方法主要是普通多重PCR方法，熒光PCR方法是不是可以大幅度提高檢出率，是否可以逐步替代普通PCR方法還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本文所使用的多重PCR方法，檢測(cè)的毒力基因與沈陽(yáng)、泰州相似[6，12]，其中ETEC是淮安市DEC感染主要優(yōu)勢(shì)菌株，和新疆烏魯木齊[13]監(jiān)測(cè)結(jié)果相似，有明顯地方特點(diǎn)。

ETEC的感染多發(fā)于幼童，發(fā)病率和病死率較高，同時(shí)也是引起游客腹瀉的主要原因[14]。據(jù)報(bào)道每年ETEC感染發(fā)病有2.8億～4.0億例，造成30萬(wàn)～50萬(wàn)死亡[15]。多年來(lái)，對(duì)人源產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌疫苗的研發(fā)一直是科研研究中的重點(diǎn)[16]。預(yù)防ETEC感染所致腹瀉對(duì)于控制淮安市DEC的發(fā)病率，減少腹瀉的發(fā)生起至關(guān)重要的作用。

淮安DEC所致腹瀉發(fā)病率從季節(jié)上比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，符合細(xì)菌感染性腹瀉的發(fā)病特征，淮安市夏秋季節(jié)溫度較高，空氣比較潮濕，溫暖潮濕的環(huán)境更適合病原菌存活，從而加大易感人群的感染率。此外，不同年齡段的發(fā)病率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，≤5歲和6～18歲兩個(gè)年齡段的發(fā)病率明顯高于其他年齡段，符合感染性腹瀉的發(fā)病特征，也提示了淮安市的腹瀉監(jiān)測(cè)對(duì)象應(yīng)主要以這兩個(gè)年齡段的人群為主。

總之，本文通過(guò)對(duì)淮安市DEC所致腹瀉病例信息的收集、匯總、分析及病原學(xué)檢驗(yàn)，了解了淮安市DEC的流行趨勢(shì)，為淮安市DEC感染預(yù)防方案的制定和控制措施的提出提供了可靠依據(jù)。

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Detection and analysis on epidemic characteristics of diarrheogenic Escherichia coli in Huaian,2013-2015.

LI Shuang-shu1,2,LIU Chun-cheng2,LI Bing-bing2,LIU Han2,ZHU Ye-fei1,3.1.School of Public Health,Nanjing Medical University,Nanjing 210029,Jiangsu,CHINA;2.Huaian Center For Disease Control and Prevention,Huaian 223001, Jiangsu,CHINA;3.Medical Center Inspection,the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210011,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo understand the detection situation and epidemiological characteristics of diarrheogenic Escherichia coli(DEC)in Huaian from 2013 to 2015,so as to provide evidence basis for prevention and treatment of disease.MethodsAtotal of 795 stool specimens were isolated from patients in sentinel hospitals and community hospitals of Huaian from 2013 to 2015 for detection of Escherichia coli.Diarrheogenic E.coli strains were screened by multiple PCR and verified by biochemical identification.ResultsA total of 80 diarrheogenic Escherichia coli strains were isolated,with a detection rate of 10.06%,including 34 strains of enterotoxigenic E.coli(ETEC),18 strains of enteroaggregative E.coli(EAEC),16 strains of enteropathogenic E.coli(EPEC),7 strains of enteroinvasive E.coli(EIEC)and 5 strains of enterohemorrhage E.coli(EHEC).There were statistical differences(P＜0.05)between seasons,and the positive detection rate in autumn and summer were higher.There was no significant difference between urban and rural areas (P＞0.05).There was no significant difference in the positive detection rates between different genders from the population distribution analysis(P＞0.05),but there were significant differences between the different age groups(P＜0.05).ConclusionETEC is the predominant type of diarrheogenil E.coli in Huaian.The detection rates are higher in summer and autumn,and also in patients aged≤5 years and 6～18 years.Monitoring of key periods and population should be strengthened in the future.

Huaian;Diarrhea;Diarrheogenic Escherichia coli;Epidemic characteristics

R378.2+1

A

1003—6350（2016）19—3137—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.19.014

2016-03-14)

朱葉飛。E-mail：zhu_yefei@163.com