吳文特，劉彬，楊巧，陽海清

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨外科，湖南 衡陽 421001)

·論 著·

DADS對人骨肉瘤細胞U-20S生物學(xué)活性的影響

吳文特，劉彬，楊巧，陽海清

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨外科，湖南 衡陽 421001)

目的 探討二烯丙基二硫(DADS)對人骨肉瘤細胞U-20S生物學(xué)活性的影響。方法將人骨肉瘤U-20S細胞隨機分為DADS處理組與空白組，DADS處理組又分為15 mg/L、30 mg/L、60 mg/L、120 mg/L 4個不同濃度小組，每組分別作用于U-20S細胞24 h、48 h、72 h后進行相關(guān)檢測，每組實驗重復(fù)3次。采用MTT比色法測量不同的吸光值以檢測DADS對人骨肉瘤細胞U-20S的抑制作用；Annexin V-FITC/PI染色法及流式細胞術(shù)檢測骨肉瘤細胞凋亡率及細胞周期變化情況；Transwell侵襲實驗通過計量同一視野下細胞數(shù)量以檢測細胞侵襲能力；細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力。結(jié)果MTT比色法結(jié)果顯示，濃度為60 mg/L DADS處理組作用于U-20S細胞24 h后其吸光值比對照組低(P＜0.05)。隨著濃度的增加，DADS對骨肉瘤細胞抑制作用無明顯增強，表明DADS對骨肉瘤細胞有抑制作用，但并不呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系；染色法及流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，60 mg/L DADS作用于U-20S細胞24 h凋亡率為15.89%，高于空白組細胞的8.65%；60 mg/L DADS作用于U-20S細胞24 h，G2/M期的細胞為10.44%，高于空白組G2/M期的細胞8.18%(P＜0.05)；侵襲試驗結(jié)果顯示，DADS處理組細胞計數(shù)為(63±2)個，較空白組細胞計數(shù)(104±3)個顯著減少(P＜0.05)，表明DADS處理組能抑制細胞侵襲能力；細胞劃痕試驗結(jié)果顯示，60 mg/L DADS處理組細胞劃痕之間的距離大于空白組，以作用48 h抑制作用最為顯著(P＜0.05)，表明DADS(濃度為60 mg/L)能抑制U-20S細胞的遷移，并且隨著時間的增加，48 h抑制作用更加顯著。結(jié)論DADS能抑制骨肉瘤細胞株U-20S增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

二烯丙基二硫；骨肉瘤；凋亡；增殖；侵襲；轉(zhuǎn)移

骨肉瘤是臨床上最為常見的惡性骨腫瘤，主要發(fā)生于青少年患者，好發(fā)部位是長骨的干骺端，具有高度惡性、早期轉(zhuǎn)移及病死率極高等特點[1-2]。未發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的患者5年生存率為70%，而出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者5年生存率僅為20%左右[3-5]。對于生長在脊柱、顱底、骨盆等特殊部位的骨肉瘤患者以及腫瘤切除術(shù)后復(fù)發(fā)的患者，只能采用化療作為姑息性治療方法來延長患者的生存期[6-12]。

二烯丙基二硫(Diallyl disulfide，DADS)是大蒜中的一種脂溶性成分。近年來有研究報道DADS具有抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用[13-14]。本文采用人骨肉瘤U-20S細胞株，進行細胞體外實驗，探討DADS對人骨肉瘤U-20S細胞增殖、凋亡、細胞周期和遷移的影響，為以后DADS作為一種治療骨肉瘤的新型化療藥物應(yīng)用于臨床提供理論和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 DADS(Fluka公司)；Tween 80 (對照組，華美生物工程公司)；1640培養(yǎng)液(Hyclone)；胎牛血清(FBS，Gibco)；胰酶消化液(Hyclone)；青霉素-鏈霉素溶液 (碧云天)；MTT(Sigma)；Annexin V-FITC/PI雙染色凋亡檢測試劑盒。

1.2 實驗器材 CO2培養(yǎng)箱：GOLD-SIM公司生產(chǎn)，型號：W200IR。超凈工作臺：成都市蘇凈科學(xué)器材有限公司生產(chǎn)，型號：SW-CJ-1F。光學(xué)顯微鏡：OLYMPUS公司生產(chǎn)。小型臺式冷凍離心機：Thermo Scientific公司生產(chǎn)，型號：FRESCO17。普通高速離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠，型號：TDL-5-A。立式超低溫冰箱：日本三洋公司生產(chǎn)，型號：MDF U52V。普通冰箱：河南新飛電器有限公司生產(chǎn)，型號：BCD-252K。實驗室超純水器：Kertone Ltd公司生產(chǎn)，型號：P10-Y。高壓滅菌鍋：STIK(上海)公司生產(chǎn)，型號：MJ-54A。掃描儀：上海天能科技有限公司生產(chǎn)，型號：Ranon GIS-2008。制冰機：華美公司生產(chǎn)，型號：XUEKE。搖床：上海澤權(quán)儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)，型號：Enviro-Genie。恒溫水浴槽：Pharmacia公司生產(chǎn)，型號：SY-1210。微量移液器：德國Eppendorf公司生產(chǎn)。多功能PCR儀：Applied Biosystems公司生產(chǎn)，型號：2720。

1.3 實驗方法 將人骨肉瘤U-20S細胞隨機分為DADS未處理組(空白組)和DADS處理組。DADS處理組又根據(jù)濃度不同分為15 mg/L、30 mg/L、60 mg/L、120 mg/L 4個不同濃度小組，分別作用于U-20S細胞24 h、48 h、72 h。

1.4 MTT比色法檢測人骨肉瘤細胞U-20S的增殖能力 選取U-20S細胞培養(yǎng)于1640胎牛血清培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)細胞密度達80%左右，使用胰酶消化細胞，一瓶分為二瓶，進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的U-20S細胞，胰酶消化細胞，調(diào)整細胞密度約1×105個/mL。鋪3個96孔板，分別標記為24 h、48 h、72 h，每板15個孔，每孔加入100μL細胞懸浮液，37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。取出3個96孔板，去除舊的培養(yǎng)基，分別對應(yīng)加入已配制好的含DADS的培養(yǎng)基，每組設(shè)立3個復(fù)孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，記錄處理好的時間。待藥物處理24 h后，取出對應(yīng)96孔板，每孔加入20μL 5 mg/mL的MTT溶液，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，吸去舊的培養(yǎng)基和MTT混合溶液，每孔加入150μL DMSO溶液，室溫下緩慢搖晃10 min，490 nm處測定吸光度值并記錄結(jié)果。采用同樣的方式于對應(yīng)時間處理48 h、72 h樣品。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 選取空白組、DADS(60 mg/L，處理24 h)兩組，使用不含EDTA的胰酶消化收集兩組細胞，使用PBS洗滌細胞兩次，以每次2 000 r/min離心5 min，收集1～5×105個細胞，依次加入500μL的Binding buffer懸浮細胞、5μL Annexin V-FITC、5μL Propidium Iodide，混勻后置于室溫、避光處，反應(yīng)5～15 min，在流式細胞儀觀察檢測。

1.6 流式細胞儀檢測細胞周期 選取空白組、DADS(60 mg/L，處理24 h)兩組，U-20S細胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液一次，培養(yǎng)至細胞密度達80%左右，使用胰酶消化后使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2～3次制成單細胞懸液，并調(diào)整細胞數(shù)量至1×106個/mL。選取1 mL預(yù)冷PBS重懸細胞加入離心管，800 r/min離心5 min，吸凈上清后再加入400μL PBS液，輕輕重懸細胞，使細胞分離為單個，逐滴加入預(yù)冷的100%乙醇1.2 mL，使其終濃度為75%，放置于4℃環(huán)境下過夜固定。隔日取出固定的樣品，800 r/min離心5 min，棄去上清后加入1 mL預(yù)冷的PBS重懸細胞，800 r/min離心5 min，離心收集細胞，去除乙醇后加入150μL PI(碘化丙啶)工作液，放置于溫度為4℃環(huán)境中避光染色30 min后轉(zhuǎn)至流式檢測管進行檢測。PI用488 nm氬離子激光器激發(fā)，由630 nm通濾光片接收，通過FSC/SSC散點圖收集10 000個細胞，采用設(shè)門技術(shù)，排除粘連細胞和碎片，分析PI熒光直方圖上各細胞周期的百分率。

1.7 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 (1)制備Transwell小室：冰上操作，吸取120μL Matrigel膠及無血清培養(yǎng)基240μL按1:2進行稀釋，每個小室鋪膠60μL，共制作成6個小室，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)60 min使膠凝固；(2)水化基底膜：吸出小室內(nèi)殘余液體，每個小室加入70μL無血清DMEM培養(yǎng)基，放置于37℃、30 min水化基底膜；(3)制備細胞懸液：將處理好的細胞用0.25%的胰酶進行消化后用無血清培養(yǎng)基制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，設(shè)置空白組和60 mg/L DADS處理組兩組，處理24 h；(4)接種：吸取100μL液加入侵襲小室內(nèi)，下室中加入含10%FBS的DMEM，培養(yǎng)24 h；(5)染色：棄去小室內(nèi)培養(yǎng)液，用PBS洗兩遍后用濕棉簽擦盡上室面的細胞，丙酮:甲醇=1:1液，固定20 min后PBS洗滌兩遍，0.1%結(jié)晶紫染色20 min后用清水洗滌3次以上；(6)細胞計數(shù)：電子顯微鏡下觀察并記錄實驗結(jié)果。

1.8 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 選取空白組和DADS兩組，取1塊無菌6孔板，用Marker筆在孔的背面每隔0.5 cm平均畫出5道平行標記線，在孔中加入約含5×105個U-20S細胞的細胞液，待細胞貼壁后加入60 mg/L DADS液處理細胞24 h后再用槍頭對比直尺劃痕，PBS洗滌細胞3次后去除劃下的細胞，加入低血清培養(yǎng)基(1%～2%的血清)，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按0 h、24 h、48 h時間點取樣并標記。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用t檢驗。檢驗水準為雙側(cè)α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法檢測人骨肉瘤細胞U-20S的增殖 表1和圖1結(jié)果顯示，與對照組比較，濃度為60 mg/L DADS處理組在作用細胞24 h其吸光值最低，對U-20S細胞具有顯著的抑制作用(P＜0.05)。DADS在24 h對細胞有抑制作用，濃度為60 mg/L時抑制效果最佳，48 h和72 h的抑制效果不明顯。表明DADS對骨肉瘤細胞有抑制作用，以濃度為60 mg/L，作用24 h對骨肉瘤細胞U-20S抑制作用最大，但并不呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。

2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡流式細胞術(shù)實驗結(jié)果 60 mg/L DADS作用于U-20S細胞24 h凋亡率為15.89%(UR=11.53%，LR=4.36%)，見圖2，高于空白組細胞的8.65%(UR=3.02，LR=5.63)，見圖3，表明DADS可以促進U-20S細胞的凋亡。

組別對照組DADS組濃度0 mg/L 15 mg/L 30 mg/L 60 mg/L 120 mg/L 24 h 0.460±0.008 0.649±0.052 0.575±0.124 0.417±0.031a0.488±0.093 48 h 0.719±0.021 0.770±0.044 0.722±0.071 0.723±0.039 0.551±0.017 72 h 0.888±0.051 0.861±0.026 0.850±0.074 0.837±0.032 0.709±0.008注：與對照組比較，aP＜0.05。

圖1 DADS對U-20S細胞增殖的抑制作用

圖2 空白組細胞凋亡情況

圖3 DADS組細胞凋亡情況

2.3 流式細胞儀檢測細胞周期流式細胞術(shù)方法檢測 空白組G1/0期的細胞占總細胞的76.10%，熒光強度為79.15；G2/M期的細胞占總細胞的8.18%，熒光強度為146.43(見圖4)；而DADS組G1/0期的細胞占總細胞的74.06%，熒光強度為89.90；G2/M期的細胞占總細胞的10.44%，熒光強度為166.32(見圖5)。與空白組比較，濃度為60 mg/L DADS處理組的細胞周期分布發(fā)生了顯著改變，處于G2/M期的細胞數(shù)目顯著增多，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.562，P＜0.05)，表明DADS可阻滯U-20S細胞于G2/M期。

圖4 空白組細胞周期情況

圖5 DADS組細胞周期情況

2.4 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 通過電子顯微鏡計數(shù)，DADS組細胞計數(shù)為(63±2)個，空白組細胞計數(shù)為(104±3)個，兩組比較，DADS處理組細胞較空白組顯著減少，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t= 3.153，P＜0.05)，表明DADS可以抑制U-20S細胞的侵襲能力。見圖6和圖7。

圖6 空白組細胞計數(shù)(×400)

圖7 DADS組細胞計數(shù)(×400)

2.5 劃痕試驗檢測細胞遷移能力 劃痕試驗結(jié)果顯示：DADS(濃度為60 mg/L)處理后細胞間的劃痕距離較對照組大，表明DADS能抑制U-20S細胞的遷移，并且隨著時間的增加抑制能力逐漸增強，作用48 h后抑制作用更加顯著(P＜0.05，圖8～圖13)。在劃痕每側(cè)邊緣隨機選取30個點后取其中線代表劃痕邊緣，測量不同時間點劃痕邊緣的最小距離，計算劃痕邊緣之間的平均距離，比較空白組和DADS處理組不同時間點劃痕之間的距離，表明60 mg/L DADS能抑制U-20S細胞的遷移，并且隨著時間的增加，48 h抑制作用更加顯著。見表2。

圖8 空白組0 h細胞遷移情況(×400)

圖9 空白組24 h細胞遷移情況(×400)

圖10 空白組48 h細胞遷移情況(×400)

圖11 DADS組0 h細胞遷移情況(×400)

圖12 DADS組24 h細胞遷移情況(×400)

圖13 DADS組48 h細胞遷移情況(×400)

表2 使用Image-Pro Plus軟件測量圖片中劃痕之間的距離(±s，n=3)

表2 使用Image-Pro Plus軟件測量圖片中劃痕之間的距離(±s，n=3)

組別空白組DADS組0 h 889.2±1.39 996.4±1.86 24 h 660.4±5.38 708.6±4.30 48 h 536.6±2.58 574.2±1.59

3 討 論

骨肉瘤是臨床上最為常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，具有惡性程度高、早期轉(zhuǎn)移率高、病情進展迅速且病死率高等特點，其發(fā)病率呈上升趨勢。

二烯丙基二硫(Diallyl disulfide，DADS)是大蒜素的主要成分，許多研究已證實DADS對胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、白血病、結(jié)腸癌等多種腫瘤的生長均有抑制作用，并且具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、調(diào)節(jié)致癌物質(zhì)代謝、抑制血管生成的作用[15-21]。對體內(nèi)外的多種惡性腫瘤細胞及血液系統(tǒng)相關(guān)疾病，DADS均有抗增殖作用[21-26]。本實驗研究了DADS對人人骨肉瘤細胞U-20S生物學(xué)活性的影響。結(jié)果顯示，DADS能抑制骨肉瘤細胞株U-20S增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。MTT試驗顯示：不同濃度的DADS對U-20S細胞增殖均有抑制作用，但同一濃度的DADS作用不同時間，對細胞增殖的抑制作用亦不相同。DADS對細胞增殖的抑制作用并不隨著時間及濃度增加而增強，其中以15 mg/L的DADS作用24 h對細胞增殖抑制作用最小，60 mg/L的DADS作用24 h對細胞增殖抑制作用最大，可能與濃度增加及作用時間延長導(dǎo)致某些蛋白表達水平增高或降低相關(guān)凋亡細胞可被用于細胞活性鑒定的染料染色，而壞死細胞則不能。細胞膜有損傷的細胞的被染色后可產(chǎn)生紅色熒光，反之，細胞膜完整的細胞則不會出現(xiàn)紅色熒光，基于這一特性，通過流式細胞術(shù)檢測DADS處理組及空白組細胞凋亡率的結(jié)果顯示：處理組細胞凋亡率明顯大于對照組細胞的凋亡率，其中晚期凋亡細胞占主要部分流式細胞術(shù)測定細胞周期結(jié)果顯示：DADS處理組G2/M期細胞百分率為10.44%，而空白對照組G2/M期細胞百分率為8.18%，DADS可將U-20S細胞阻滯在G2/M期，表明DADS抑制U-20S細胞增殖與G2/M期阻滯有密切關(guān)系，這可能是DADS抗腫瘤作用的機制之一，但其具體分子作用機制尚不清楚，有待于進一步的研究證實。細胞Transwell侵襲實驗及劃痕試驗中，DADS能抑制U-20S細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，這可能與上調(diào)或下調(diào)某些蛋白的表達水平有關(guān)，但其具體的分子通路及作用機制帶有待進一步實驗研究。

近些年來，新型的抗腫瘤藥物不斷涌現(xiàn)，其中大部分是來源于植物類。而新型的抗腫瘤藥物不僅可以為我們提供更安全、更有效的治療選擇，亦能減少化療藥物的一部分副作用。DADS具有來源極其廣泛、價格低廉等優(yōu)點。本實驗通過不同檢查方法檢測DADS對人骨肉瘤U-20S細胞的生物學(xué)活性影響，證實了DADS能誘導(dǎo)人骨肉瘤U-20S腫瘤細胞凋亡，抑制U-20S細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，能夠為臨床上治療骨肉瘤提供新的輔助方法，具有良好的前景。

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Effect of DADS on the biological activity of human osteosarcoma cell line U-20S.

WU Wen-te,LIU Bin,YANG Qiao, YANG Hai-qing.Department of Bone Surgery,the First Affiliated Hospital of University of South China,Hengyang 421001, Hunan,CHINA

ObjectiveTo explore the effect of DADS on the biological activity of human osteosarcoma cell line U-20S.MethodsThe cells of U-20S were randomly divided into DADS treatment group and the blank group. DADS treatment group was divided into 15 mg/L,30 mg/L,60 mg/L,120 mg/L four different concentration groups,and U-20S cells of each group were separately treated for 24 h,48 h,72 h.Then relative tests were performed.Each experiment was repeated 3 times.The inhibitory effect of DADS on human osteosarcoma cell line U-20S were detected by MTT colorimetric.The apoptosis rate and cell cycle changes of osteosarcoma cells were detected by Annexin V/PI technique and flow cytometry.The cell invasion ability was measured by Transwell testing.The metastasis of U-20S cells induced by DADS was analyzed by cell scratch experiment testing.ResultsThe results of MTT showed that the cell absorbance in 60 mg/L DADS treatment group after 24 hours was lower than that of blank group(P＜0.05).With the increase of concentration,the inhibitory effect of DADS on the osteosarcoma cells showed no obvious improvement, which indicated that DADS had inhibitory effect on human osteosarcoma cells,but not in a dose-dependent effect.Staining and flow cytometry results displayed that the cell apoptosis rate was 15.89%in 60 mg/L DADS treatment group after 24 h,which was higher than the cell apoptosis rate(8.65%)in blank group after 24 hours.The proportion of G2/M phase cells was 10.44%in DADS treatment group after 24 h,which was higher than that(8.18%)in blank group after 24 hours (P＜0.05).Invasive test results showed that the cell count for DADS treatment group was(63±2),which was less than (104±3)in blank group(P＜0.05).The results suggested that DADS treatment group can inhibit cell invasion ability.Cell scratch test results showed that the cell scratch distance in 60 mg/L DADS groups was greater than that in blank group, which showed that DADS(60 mg/L)could inhibit the migration of U-20S cells,and with the increase of time,the inhibitory effect reached the peak after 48 hours(P＜0.05).ConclusionDADS can inhibit the proliferation,induce cell apoptosis,and inhibit cell invasion and metastasis of osteosarcoma cell line U-20S.

Diallyl disulfide;Osteosarcoma;Apoptosis;Proliferation;Invasion;Metastasis

R738

A

1003—6350（2016）10—1549—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.001

2015-11-26)