吳瓊，楊友輝，王文華，孫佳，薛維娜，何彬，龔菲，劉亭

(貴州醫(yī)科大學貴州省藥物制劑重點實驗室1、醫(yī)藥衛(wèi)生管理學院2、民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心3，貴州 貴陽 550004)

·論 著·

參芎葡萄糖注射液及其丹參組分對小鼠核受體表達的調控作用

吳瓊1，楊友輝1，王文華1，孫佳1，薛維娜2，何彬3，龔菲3，劉亭1

(貴州醫(yī)科大學貴州省藥物制劑重點實驗室1、醫(yī)藥衛(wèi)生管理學院2、民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心3，貴州 貴陽 550004)

目的 考察參芎葡萄糖注射液(SGI)及其丹參組分(SM)對小鼠肝細胞中芳香烴受體(AhR)、肝細胞核因子4α(HNF-4α)、孕烷X受體(PXR)和過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)mRNA表達的影響。方法采用隨機數(shù)表法將40只雄性小鼠分為8組，每組5只，分別為空白組、陽性組(苯巴比妥)、SGI低劑量組(以丹參素計2.6 mg·kg-1·d-1)、SGI中劑量組(以丹參素計3.9 mg·kg-1·d-1)、SGI高劑量組(以丹參素計5.2 mg·kg-1·d-1)、SM低劑量組(以丹參素計2.6 mg·kg-1·d-1)、SM中劑量組(以丹參素計3.9 mg·kg-1·d-1)、SM高劑量組(以丹參素計5.2 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)給藥7 d。提取各組小鼠肝臟組織中的RNA，檢測相關核受體mRNA的變化。結果與空白組相比，SGI高劑量組可以上調AhR mRNA的水平(P＜0.05)，上調倍數(shù)為1.7倍，但是SGI對PPARα、PXR、HNF-4α的mRNA水平沒有顯著性影響(P＞0.05)；SM對AhR、PPARα、PXR和HNF-4α的mRNA表達均無顯著性影響(P＞0.05)。結論高劑量的參芎葡萄糖注射液能夠影響AhR mRNA的表達，但這種影響并不是由其丹參組分導致的。

核受體；小鼠；熒光定量PCR；參芎葡萄糖注射液；丹參

細胞色素P450氧化酶(CYP450)是人體內最主要的藥物氧化代謝酶，CYP酶在藥物代謝過程中有著很重要的作用。大量的研究證實CYP被激活或被抑制是引起藥物相互作用和導致藥物不良反應增加或療效降低的重要原因[1]。參芎葡萄糖注射液具有抗血小板聚集、降低血液黏度、改善微循環(huán)、抗心肌缺血和心肌梗死的作用，臨床上主要用于閉塞性腦血管病及其他缺血性血管疾病等[2]。參芎葡萄糖注射液的藥理作用廣泛，與其他藥物聯(lián)用的機會也比較大，可能會發(fā)生藥物之間的相互作用。課題組前期實驗表明，參芎葡萄糖注射液及其丹參組分均能夠引起CYP450的活性和表達的變化，但其具體機制尚不明確。核受體在CYP450的轉錄調控中起到了重要的作用，PPARα、HNF-4α、PXR和AhR是調控CYP450基因表達的主要的核受體，這些核受體的表達水平影響著藥物代謝。因此，本實驗將采用實時熒光定量PCR技術，檢測參芎葡萄糖注射液及其丹參組分對小鼠肝組織中4種主要CYP450亞型的核受體mRNA水平的影響，從核受體表達調控，初步闡明參芎葡萄糖注射液及其丹參組分影響細胞色素P450氧化酶活性和表達的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級昆明種雄性小鼠40只，體質量22～25 g，由貴陽醫(yī)學院實驗動物房提供，動物合格證號：SCXK(黔)2012-0001。

1.2 藥品與試劑 SGI(貴州景峰注射劑有限公司，批號H52020703)；SM(貴州景峰注射劑有限公司，批號20131006)；苯巴比妥(北京索萊寶科技有限公司，批號20150508)；Trizol(Invitrogen，批號79402)；Eastep總 RNA提取試劑盒(Promega，批號 20140801)；TransScriptTMOne-Step RT-PCR SuperMix(大連寶生物有限公司，批號RR047A)；AhR、PPAR α、PXR、HNF-4α以及GAPDH的引物由上海生工生物公司合成；DEPC水(上海生工生物有限公司，批號LZ0223S14014L)；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(大連寶生物有限公司，批號RR820A)；50×TAE溶液(上海生工生物有限公司，批號B914KA1135)；4S Red Plus Nucleic(上海生工生物有限公司，批號AC29BC025)。

1.3 實驗儀器 CFX96實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)；Biomate 3S核酸蛋白紫外測定儀(美國Thermo公司)；CQ-250A-ST超聲波清洗器(上海躍進醫(yī)用光學器械廠)；Thermo fresco 17高速冷凍離心機(美國Thermo公司)；凝膠成像儀(基因有限公司)；恒溫水浴鍋(精宏)；電泳儀器(美國BIO-RAD公司)；EL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；超純水機(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)；超低溫冰箱(Thermo Fisher)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 實驗小鼠隨機分為8組，每組5只，分別給予生理鹽水、苯巴比妥、SGI低劑量(以丹參素計2.6 mg·kg-1·d-1)、SGI中劑量(以丹參素計3.9 mg·kg-1·d-1)、SGI高劑量(以丹參素計5.2 mg·kg-1·d-1)、SM低劑量(以丹參素計2.6 mg·kg-1·d-1)、SM中劑量(以丹參素計3.9 mg·kg-1·d-1)、SM高劑量(以丹參素計5.2 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)7 d給藥。

1.4.2 總RNA的提取 末次給藥禁食16 h，斷頸處死，剪開腹腔取其肝臟，用預冷的生理鹽水將肝臟的血沖洗干凈。取大約20 mg的肝臟于已除RNA酶的手動玻璃勻漿器中，在冰上加入1 mL Trizol進行勻漿，把勻漿液倒入1.5 mL的離心管中，靜置5 min；每1 mL Trizol中加入0.2 mL的氯仿，蓋緊樣品管蓋，渦旋15 s，使其充分混勻，室溫靜置5 min，低溫離心(12 000 r/min，15 min)；取上清400 μL，緩慢加入200 μL的無水乙醇，混勻，并按Eastep RNA提取試劑盒說明書，提取純化肝臟總RNA。

1.4.3 RAN質量檢測 取RNA樣品10 μL加入DEPC水990 μL稀釋100倍，用核酸蛋白紫外測定儀檢測RNA樣品260 nm、280 nm波長下的吸收度。根據(jù)A260值計算樣品濃度，用A260/A280比值判斷樣品純度。采用1.5%瓊脂糖凝膠，1×TAE，恒壓(5 V/cm)，電泳30 min，通過28S和18S條帶灰度值比值來分析RNA樣品的完整性。

1.4.4 逆轉錄反應 逆轉錄采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa)試劑盒，在冰浴中調配混合試劑至離心管，逆轉錄反應體系見表1。將反應體系置于渦旋機渦旋混勻，低溫離心約30 s，置于恒溫水浴鍋中：42℃15 min，85℃5 s，將合成好的cDNA保存在-20℃冰箱備用。

表1 逆轉錄反應體系

1.4.5 Real-time PCR反應 特異性引物序列見表2。熒光定量PCR反應使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑(TaKaRa)，在冰上配制熒光定量PCR反應體系20.0 μL見表3，加入到專用的八聯(lián)PCR管。每個樣品的目的基因進行3個重復反應孔，在CFX96熒光定量PCR儀上進行反應。反應參數(shù)：95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，共40個循環(huán)。循環(huán)結束后繪制溶解曲線以及擴增曲線。每次擴增均設置GAPDH作為內參，分析并計算待測樣本的循環(huán)數(shù)(Ct)，用2-△△Ct方法分析數(shù)據(jù)。

基因AhR HNF-4α PXR PPARα GAPDH序列號NM013464 NM008261 AF031814 X89577 M32599上游引物accagaactgtgagggttgg cggagcccctgcaaagt cccatcaacgtagaggagga ccatacaggagagcagggattt agtatgactccactcacggcaaat下游引物ctcccatcgtatagggagca ccagtctcacagcccattcc tctgaaaaaccccttgcatc ttacctacgctcagccctcttc gtctcgctcctggaagatggt

PCR反應體系cDNA SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×) PCR Forward Primer(20μmol/L) PCR Reverse Primer(20μmol/L) ddH2O共計體積(μL) 2.0 10.0 0.4 0.4 7.2 20.0

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 提取總RNA的質量檢測 所提取的RNA條帶清晰，28S條帶的灰度值約為18S條帶的2倍左右；RNA的純度可用紫外分光光度計檢測，提取的總RNA的A260/A280值在1.8～2.1之間，證明所提的總RNA純度高、污染低，說明提取的RNA純度滿足實驗要求。

2.2 SGI及SM對AhR、HNF-4α、PXR和PPARα mRNA水平的影響 利用實時熒光定量PCR技術考察了SGI和SM對小鼠肝臟4種核受體mRNA水平的影響，數(shù)據(jù)見表4和表5。結果表明，苯巴比妥組可以上調小鼠的AhR、PXR、HNF-4α、PPARα的mRNA的水平(P＜0.05)；SGI高劑量組AhR的mRNA水平為空白組的1.73倍(P＜0.05)；與空白組比較，SGI對小鼠的PXR、PPARα、HNF-4α的mRNA水平沒有顯著影響(P＞0.05)，SM對小鼠的AhR、PXR、HNF-4α、PPARα的mRNA水平也無顯著性影響(P＞0.05)。

組別空白對照組苯巴比妥組S G I低劑量S G I中劑量S G I高劑量A h R m R N A 1 . 0 0 0 ± 0 . 1 1 5 2 . 4 2 ± 0 . 2 3 1b0 . 8 ± 0 . 0 8 6 1 . 2 7 3 3 ± 0 . 1 3 8 1 . 7 2 6 7 ± 0 . 1 1 8aP P A R α m R N A 1 . 0 0 0 ± 0 . 0 7 7 1 . 6 1 6 7 ± 0 . 0 9a1 . 3 0 6 7 ± 0 . 1 6 5 1 . 0 4 ± 0 . 0 8 0 . 7 1 ± 0 . 0 5 P X R m R N A 1 . 0 0 0 ± 0 . 0 7 2 1 . 6 1 6 7 ± 0 . 0 9 9a0 . 8 4 ± 0 . 0 8 3 0 . 9 0 6 7 ± 0 . 0 6 3 1 . 1 0 6 7 ± 0 . 0 5 8 H N F -4 α m R N A 1 . 0 0 0 ± 0 . 1 0 5 2 . 6 3 6 7 ± 0 . 0 9b1 . 2 7 3 3 ± 1 . 2 7 1 . 3 9 6 7 ± 1 . 3 9 1 . 3 9 3 3 ± 1 . 3 9注：與空白組比較，aP＜0 . 0 5，bP＜0 . 0 1。

表5 SM對小鼠肝核受體mRNA表達的影響(±s)

表5 SM對小鼠肝核受體mRNA表達的影響(±s)

注：與空白組比較，aP＜0.05，bP＜0.01。

組別AhR mRNA PPARα mRNA PXR mRNA HNF-4α mRNA空白對照組苯巴比妥組SM低劑量SM中劑量SM高劑量1.000±0.105 2.066±0.145a1.506±0.069 1.483±0.084 1.302±0.070 1.000±0.077 1.466±0.09 1.32±0.065 1.142±0.049 0.85±0.33 1.000±0.056 1.315±0.055 0.903±0.063 0.972±0.076 1.04±0.058 1.000±0.085 2.136 7±0.32b1.093±0.09 1.05±0.106 1.066±0.144

3 討 論

細胞色素P450酶多表達于肝臟，其中CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4以及CYP2D6是肝內最主要的P450亞型，負責代謝大多數(shù)的藥物。研究表明，細胞色素P450 mRNA的表達與藥物之間相互作用有密切相關，且小鼠體內存在與人基因同源或同功的基因，對小鼠進行研究，對人亦具有重要參考意義[3]。

核受體在外源性物質對轉錄水平的基因表達調控中起著重要的作用。近年來，研究人員對細胞色素P450酶的調控因子進行了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)大部分CYP1A、2B、2D、2E、3A等家族成員的表達受到核受體的調節(jié)[4]。AhR調控CYP1A家族的表達，HNF-4α主要調節(jié)CYP2D的水平；PXR主要激活CYP3A異構體；PPARα激活CYP2E亞型等[5]。在課題組前期研究中，已經發(fā)現(xiàn)參芎葡萄糖注射液對小鼠肝細胞色素P450酶的表達和活性有誘導作用。因此，本文進一步研究了參芎葡萄糖注射液及其丹參組分對主要亞型酶的核受體的影響，初步闡明參芎葡萄糖注射液對小鼠肝細胞色素P450酶表達的調控機制。給藥7 d后，參芎葡萄糖注射液及其丹參組分對PXR、HNF-4α和PPAR α的表達沒有顯著性影響，但參芎葡萄糖注射液能夠上調AHR的mRNA表達。

CYP1A2在前致癌物的代謝活化中發(fā)揮了重要作用，它的活性與許多藥物的療效或毒性密切相關，是引起代謝性藥物相互作用的重要亞型。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，參芎葡萄糖注射液對小鼠肝臟中CYP1A2活性和表達有誘導作用。有文獻報道，AhR主要調控CYP1A2的表達[5]。誘導劑與AhR相結合，形成復合物進入細胞核與轉運因子結合成異二聚體，該異二聚體通過與CYP1A2啟動子上游的特異性結合位點結合，從而調節(jié)CYP1A2的轉錄，改變CYP1A2的表達，起到誘導作用[6]。AhR水平的上調，通常能上調CYP1A2的表達。因此，我們推斷，參芎葡萄糖注射液對小鼠肝臟中CYP1A2表達的誘導作用很可能與其上調AhR水平有關。

本實驗結果表明，參芎葡萄糖注射液上調CYP1A2的基因表達的特性，很可能與其上調AhR轉錄水平相關。但是丹參組分并不能上調AhR mRNA水平，參芎葡萄糖注射液上調AhR表達很可能與其另一組分川芎嗪相關，這有待進一步的研究證實。

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[2]唐東暉.參芎膠囊聯(lián)合銀杏葉提取物治療腦血管性癡呆的臨床觀察[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志,2013,22(23):2542-2543.

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Effects of Shenxiong Glucose Injection and the component of Salvia miltiorrhiza in regulation of nuclear receptor expression in mice liver.

WU Qiong1,YANG You-hui1,WANG Wen-hua1,SUN Jia1,XUE Wei-na2,HE Bin3,GONG Fei3, LIU Ting1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics1,School of Medicine and Health Management2, Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM3,Guizhou Medical University,Guiyang 550004,Guizhou,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects of Shenxiong Glucose Injection(SGI)and Salvia miltiorrhiza (SM)on the expressions of aryl hydrocarbon receptor(AhR),hepatic nuclear factor 4 alpha(HNF-4α),pregnane X receptor(PXR)and peroxisome proliferator activatedreceptor-α(PPARα)mRNA in mice livers.MethodsMice were divided into blank group,positive group（phenobarbital),SGI and SM different dosage groups of low-dose SGI group (2.6 mg·kg-1·d-1SM),medium-dose SGI group(3.9 mg·kg-1·d-1SM),high-dose SGI group(5.2 mg·kg-1·d-1SM) and low-dose SM group(2.6 mg·kg-1·d-1SM),medium-dose SM group(3.9 mgv·kg-1·d-1SM),high-dose SM group (5.2 mg·kg-1·d-1SM),according to the random number table.Then the mice were killed after being administered medicines once daily for consecutive 7 days.Livers were prepared to determine the expression levels of AhR,HNF-4α,PXR and PPARα mRNA by quantitative real-time PCR in mice.ResultsCompared with the blank group,AhR mRNA were increased by 1.7 times in the high-dose SGI group(P＜0.05).SGI was found to have no impact on the expressions of HNF-4α,PXR and PPARα mRNA(P＞0.05),and SM was found to have no impact on the expressions of AhR,HNF-4α, PXR and PPARα mRNA(P＞0.05).ConclusionSGI of high dose could upregulate the expression of AhR mRNA in mice livers,which is not contributed by SM.

Nuclear receptor;Mice;Real-time fluorescent quantitative PCR;Shenxiong Glucose Injection;Salvia miltiorrhiza

R-332

A

1003—6350（2016）23—3785—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.23.001

2016-05-12)

貴州省科學技術基金(編號：黔科合J字[2013]2034號)；貴州省衛(wèi)生廳科學技術基金項目(編號：gzwkj2013-1-069)；2014年貴州省教育廳大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)重點項目(編號：201410660005)；貴州省中藥現(xiàn)代化專項項目(編號：黔科合中藥字[2013]5062號)

劉亭。E-mail:1586740@qq.com