許可，李亮，林英姿

（海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571101）

FoxO3a對膠質(zhì)瘤細(xì)胞株T98G和A172侵襲能力的影響

許可，李亮，林英姿

（海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571101）

目的 探討叉形框蛋白3a(FoxO3a)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G、A172細(xì)胞侵襲能力的影響。方法將FoxO3a的RNAi干擾序列嵌入慢病毒載體pHY-LV-KD1.1產(chǎn)生重組病毒載體pHY-FoxO3a-KD；FoxO3a DNA序列克隆入慢病毒表達(dá)載體PHY-LV-OE1.6。通過Trans-Lentiviral Packaging System和Vira Power Lentiviral Expression System(Invitrogen)對重組載體進(jìn)行病毒包裝。重組后的慢病毒感染T98G、A172細(xì)胞，檢測相應(yīng)細(xì)胞株侵襲能力的改變，并通過Western blot檢測膠質(zhì)瘤侵襲相關(guān)的靶基因表達(dá)水平的變化。結(jié)果在T98G細(xì)胞中敲低FoxO3a后，腫瘤細(xì)胞侵襲能力下降并且侵襲相關(guān)基因MMP9表達(dá)水平下調(diào)；相反A172細(xì)胞中過表達(dá)FoxO3a腫瘤細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。結(jié)論FoxO3a可以影響T98G、A172細(xì)胞的侵襲能力。

膠質(zhì)瘤；T98G；A172；叉形框蛋白3a；基質(zhì)金屬蛋白酶9；細(xì)胞侵襲

腦膠質(zhì)瘤是起源于神經(jīng)外胚層的腫瘤，是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，年發(fā)病率為5/100 000[1]。目前治療方法是以手術(shù)治療為主聯(lián)合放射及化學(xué)治療等綜合治療方案。然而患者的預(yù)后并沒有得到明顯改善，平均存活時(shí)間只有12～15個(gè)月。在老年人群中，生存期不足一年[4]。叉形框蛋白3a(FoxO3a)蛋白是FoxO家族重要的成員，它在許多癌癥的病理過程中起著重要作用。盡管大多數(shù)報(bào)道認(rèn)為FoxO3a是抑癌因子[3]，近來的研究表明FoxO3a在某些癌細(xì)胞中可以促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲[4]，但在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G、A172中未見關(guān)于FoxO3a的報(bào)道。本文旨在探討FoxO3a對膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G、A172侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng) T98G、A172細(xì)胞系從中國科學(xué)院細(xì)胞庫購得(上海，中國)，人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞從美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫(Manassas，VA，USA)購得。該細(xì)胞在37℃、5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。培養(yǎng)基選用Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM；Gibco，Paisley，UK)添加10%胎牛血清(FBS)以及100 μg/mL鏈霉素和1 U/mL青霉素。

1.2 慢病毒載體的構(gòu)建與感染 通過BLOCK-iT RNAi designer(Invitrogen)設(shè)計(jì)針對FoxO3a干擾序列：FoxO3a-knockdown 3'-nockdown NAi designer'，并將合成后的序列克隆進(jìn)pHY-LV-KD1.1表達(dá)載體(本實(shí)驗(yàn)室保存)產(chǎn)生重組載體pHY-FoxO3a-KD。同時(shí)，設(shè)計(jì)一條無關(guān)序列克隆入pHY-LV-KD1.1載體作為陰性對照(NC)。人全長的FoxO3a cDNA從Open Biosystems購得。通過FoxO3a表達(dá)引物，正向：5'-ATGGCAGAGGCACCGGCTT-3'，反向：5'-GCCTGGCACCCAGCTC TGAG-3'進(jìn)行擴(kuò)增。通過XhoI/BamHⅠ酶切，膠回收純化處理后，克隆到PHY-LV-OE1.6(本實(shí)驗(yàn)室保存)重組載體用于表達(dá)FoxO3a，命名為pHY-FoxO3a-OE；空載體作為陰性對照。通過Trans-Lentiviral Packaging System和Vira Power Lentiviral Expression System(In-vitrogen)包裝病毒顆粒，并感染相應(yīng)細(xì)胞株。

1.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 2×104穩(wěn)定株細(xì)胞24孔帶有8 μm孔徑的聚碳酸酯膜并包被30 μg Matrigel(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)的Boyden小室(Corning Costar，Cambridge，MA，USA)。細(xì)胞置于上室并用200 μL無血清培養(yǎng)基進(jìn)行孵育。在下室加入20%FBS作為趨化因子。孵育36 h后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行3次清洗。上室中未發(fā)生侵襲的細(xì)胞用棉簽擦去。發(fā)生侵襲的細(xì)胞用多聚甲醛固定15 min。風(fēng)干后，用0.1%的結(jié)晶紫染色15 min。用數(shù)碼相機(jī)拍照記錄。

1.4 免疫印跡法 提取出總蛋白進(jìn)行SDS-Page電泳，然后通過濕轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移至硝化纖維膜上，用相應(yīng)的一抗過夜4℃孵育。一抗孵育使用抗體MMP9和MMP2(Santa Cruz)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 圖表上顯示的數(shù)據(jù)為三次獨(dú)立重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)方差的平均值(±s)，組內(nèi)差異通過ANOVA分析，兩組間的比較通過the Student's t-test完成。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上統(tǒng)計(jì)分析均通過GraphPad Prism6.0軟件分析完成。

2 結(jié) 果

2.1 FoxO3a對T98G、A172細(xì)胞侵襲的影響 筆者已檢測FoxO3a在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G、U251、A172和T98G以及人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)。相對于其他細(xì)胞系，T98G細(xì)胞高表達(dá)FoxO3a而A172細(xì)胞低表達(dá)FoxO3a。因此，本組通過在T98G細(xì)胞中敲低FoxO3a，同時(shí)在A172細(xì)胞中過表達(dá)FoxO3a，探究該基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的影響。如圖1所示，通過Transwell試劑盒我們檢測了陰性對照組(NC)和FoxO3a敲低組之間T98G細(xì)胞侵襲能力的差異(各組內(nèi)平行重復(fù)通過ANOVA分析。NC組P=0.413；FoxO3a敲低組P=0.570。結(jié)果表明在病毒FoxO3a-KD感染腫瘤細(xì)胞48 h后，與對照組比較，敲低組T98G的侵襲能力顯著下降(采用Student's t-test分析t=6.154，P=0.0003) (圖1)與這一結(jié)果基本一致的是，過表達(dá)FoxO3a的A172細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng)(t=13.37，P＜0.0001)，見圖1。

圖1 FoxO3a對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的影響

2.2 FoxO3a對MMP9蛋白表達(dá)的影響 在膠質(zhì)瘤中與侵襲密切相關(guān)的主要是金屬蛋白酶家族成員matrix-metalloproteinases(MMPs)的MMP9和MMP2[4]。通過Western blot技術(shù)試圖探究FoxO3a影響T98G侵襲的同時(shí)是否也影響了這兩個(gè)關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。圖2表明敲低FoxO3a主要影響MMP9的表達(dá)而對MMP2的表達(dá)影響不顯著。

圖2 FoxO3a對MMP9蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

盡管之前的研究認(rèn)為FoxO3a是腫瘤抑制因子，近來的報(bào)道表明FoxO3a可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中，F(xiàn)oxO3a與淋巴結(jié)侵襲和預(yù)后差相關(guān)[5]。結(jié)腸癌中過表達(dá)FoxO3a可引起癌細(xì)胞侵襲能力的增強(qiáng)并發(fā)生轉(zhuǎn)移[6]。這些研究提示：FoxO3a在某些癌細(xì)胞中可能表現(xiàn)為另一種功能特性——促癌作用。有報(bào)道稱FoxO3a促使膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells，GSCs)增殖和自我更新[7]。然而關(guān)于是否FoxO3a促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲未有報(bào)道。我們的結(jié)果表明在T98G、A172細(xì)胞中FoxO3a促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。

惡性膠質(zhì)瘤預(yù)后差，其中一個(gè)重要原因是膠質(zhì)瘤細(xì)胞會侵襲到周邊正常組織內(nèi)，這使得手術(shù)治療和放射性治療難以將這些腫瘤細(xì)胞徹底清除。侵襲的發(fā)生主要是由MMPs降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)導(dǎo)致。許多報(bào)道已經(jīng)證實(shí)MMP2和MMP9的表達(dá)上調(diào)易引起腫瘤細(xì)胞侵襲。通過檢測MMPs蛋白水平的表達(dá)筆者發(fā)現(xiàn)FoxO3a可以顯著影響MMP9的蛋白表達(dá)，這提示FoxO3a可能是通過MMP9影響T98G、A172膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲。我們的研究可能為未來的靶向藥物治療膠質(zhì)瘤提供新思路和新理論依據(jù)。

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Effect of FoxO3a on the invasion ability of human glioma cell line T98G and A172.

XU Ke,LI Liang,LIN Ying-zi. School of Tropical Medicine and Laboratory,Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo explore the effect of forkhead box protein O3A(FoxO3a)on the invasion ability of human glioma cell line T98G and A172.MethodsFoxO3a RNAi sequence was inserted into pHY-LV-KD1.1(a lentivirus interference vector)to generate a recombinant expressing specific RNAi against FoxO3a.FoxO3a cDNA sequence was cloned into PHY-LV-OE1.6(a lentivirus expression vector).The recombinants were packaged into lentivirus particles by Trans-Lentiviral Packaging System and Vira Power Lentiviral Expression System(Invitrogen).Following infection of T98G and A172 cells by the lentiviruses,we evaluated the cell invasion by Transwell assay as well as the protein levels of glioma invasion related target genes by Western blot.ResultsAfter knocking down FoxO3a in T98G cells, the invasion ability of tumor cells decreased and the matrix metallo proteinase-9(MMP9)expression of invasion related genes was down regulated.By contrast,overexpression ofA172 in FoxO3a cells enhanced invasion ability of tumor cells.ConclusionFoxO3a can affect the invasion ability of T98G andA172 cells.

Glioma;T98G;A172;Forkhead box protein O3A(FoxO3a);Matrix metallo proteinase-9(MMP9); Cell invasion

R739.4

A

1003—6350（2016）23—3788—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.23.002

2016-04-26)

海南省自然科學(xué)基金（編號：20158310）

林英姿。E-mail：Alan-dd-shore@hotmail.com