謝茂云，黃耀，楊莉濤，王新根

(中山大學附屬第八醫(yī)院普通外科，廣東 深圳 518033)

PDCD4對甲狀腺癌SW579細胞調亡及成瘤能力的影響

謝茂云，黃耀，楊莉濤，王新根

(中山大學附屬第八醫(yī)院普通外科，廣東 深圳 518033)

目的 研究程序性細胞死亡因子4(PDCD4)誘導的對甲狀腺癌SW579細胞凋亡效應及抑制成瘤能力的可能作用機制。方法將對數(shù)生長期的細胞分為兩組，觀察組先予以PDCD4凋亡相關基因Bax的刺激14 h進行細胞的收集，然后加入tPA刺激細胞進行收集。對照組未加PDCD4凋亡相關基因Bax的刺激和tPA刺激。應用AnnexinV/PI和API等標記，Cyclins/DNA雙標流式細胞儀檢測甲狀腺癌SW579細胞的凋亡及周期特異性，運用RT-PCR的方法檢查Caspase-3、Caspase-9活化情況。結果處于靜止期的外周血對PDCD4凋亡誘導不敏感，而G1期PDCD4誘導甲狀腺癌SW579細胞出現(xiàn)了明顯的細胞凋亡。PDCD4誘導的細胞凋亡主要是在細胞周期的G1期發(fā)生。觀察組的Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表達值分別為(1.12±0.56)、(1.10±0.29)，顯著高于對照組的(0.82±0.31)、(0.72±0.26)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論PDCD4誘導的細胞凋亡與甲狀腺癌SW579細胞的細胞周期相關，存在G1期細胞周期阻滯的周期特異性，且此過程中發(fā)生了Caspase活化，參與細胞凋亡及可能抑制細胞成瘤能力。

程序性細胞死亡因子4；甲狀腺癌SW579細胞；細胞凋亡；細胞周期；成瘤能力

甲狀腺癌約占全身惡性腫瘤的1%，近年來，甲狀腺癌發(fā)病率有逐年上升趨勢，甲狀腺癌多起病隱匿，常以無痛性甲狀腺結節(jié)為最初臨床表現(xiàn)，發(fā)病機制不明確，早期診斷較為困難。因此，研究其可能的發(fā)病機制及早期診斷預警分子，是目前甲狀腺癌臨床研究所面臨的瓶頸問題，而程序性細胞死亡因子4 (programmed cell death 4，PDCD4)是新近發(fā)現(xiàn)的與細胞凋亡相關的蛋白，其已被證實為是一種腫瘤抑制蛋白[1-3]。已有不少研究表明PDCD4在惡性腫瘤中較正常組織表達下調或缺失[4-5]，但具體機制不是十分明確。本研究的總體研究思路是通過細胞分子試驗，以期探討PDCD4抗甲狀腺癌SW579細胞凋亡的效應、分子機制以及對成瘤能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 (1)試劑：甲狀腺癌SW579細胞(中國科學院細胞庫)，DMEM培養(yǎng)液(U.S. Promega Biological Technology CO.，Ltd.)，PCR試劑盒(北京索萊寶)，流式細胞檢測用AV/PI雙染、PI單染試劑購于上海索萊寶生物科技有限公司。甲狀腺癌SW579細胞中組織型纖溶酶原激活劑tPA(上海碧云天生物)。(2)儀器：細胞培養(yǎng)超凈臺(蘇州凈化)，恒溫培養(yǎng)箱(美國Beckman Coulter公司)，PCR儀(德國Biometra公司)，倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯)，全自動低溫高速離心機(美國Beckman Coulter公司)，F(xiàn)ACSort流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)與傳代 甲狀腺癌SW579細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃孵箱中傳代培養(yǎng)。當細胞密度達到4×106以上的時候進行傳代，去除舊培養(yǎng)基，加入0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶使其完全覆蓋細胞，室溫消化3～5 min，倒置顯微鏡下觀察，當大部分細胞胞質回縮變圓時，吸去胰蛋白酶。加入新鮮的完全培養(yǎng)基，吹打貼壁細胞使之成為細胞混懸液，細胞計數(shù)，按適當比例稀釋并移至另一滅菌培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)瓶置于細胞培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2培養(yǎng)，密切觀察細胞的生長狀態(tài)。

1.3 細胞處理與分組 待細胞貼壁生長至4×106，對數(shù)是生長期的細胞分為兩組，觀察組先予以PDCD4凋亡相關基因Bax的刺激14 h進行細胞的收集，然后加入tPA刺激細胞進行收集。對照組未加PDCD4凋亡相關基因Bax的刺激和tPA刺激。

1.4 半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)取甲狀腺癌SW579細胞定量100 mg，提取總RNA，-80℃，保存，備用。取2 μg總RNA行逆轉錄cDNA，-20℃，保存cDNA。人PDCD4基因引物：上游5'-TCA GCG ACA GTG GGA GT-3'，下游5'-AGC ACG GTA GCC TTA TC-3'，PCR反應由逆轉錄產(chǎn)物cDNA 2 μL以及18sRNA和Caspase-3、Caspase-9的引物共同組成。反應過程按照標準的RT-PCR步奏進行，反應條件為：95℃預熱3 min，95℃、12 s，60℃、40 s，40個循環(huán)。接著對所得到的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，90～100 V，30～40 min。所得的電泳結果進行凝膠成像分析系統(tǒng)分析。內參選擇18sRNA作為參照，同樣完成以上PCR系統(tǒng)的成像，對得到的半定量結果進行對比分析。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞的凋亡周期 采用Annexin V/PI的方法進行凋亡的檢測，細胞離心去除培養(yǎng)基之后冷卻至4℃，進行細胞洗滌，調整濃度至106/mL，取100 μL的細胞懸液加入Annexin V-FITC和PI，避光15 min之后進行流式檢測。采用API的方法檢測細胞的凋亡周期，對收集的細胞加入Annexin V-FITC，室溫避光30 min以后用Buffer進行洗滌2次，加入不換甲醇的甲醛1 mL進行細胞固定，Buffer洗滌2次，加入PI染色劑，靜置1 h之后進行流式細胞的檢測。Cyclins/DNA雙標流式細胞儀分析甲狀腺癌SW579細胞的周期特異性，對收集的細胞采用乙醇固定過夜，將固定后的細胞用PBS沖洗2次，用TritonX-100處理5 min兩次，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，用BSA稀釋抗體，4℃過夜，第二日加用羊抗鼠IgG，室溫靜置20 min，PBS洗滌之后，加入PI和RnaseA進行DNA染色，進行流式細胞檢測。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，應用Mann-whitney U檢驗法進行兩兩數(shù)據(jù)之間比較，多個來自正態(tài)總體的樣本均數(shù)之間的比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞凋亡情況 對數(shù)生長的甲狀腺癌SW579細胞加入PDCD4誘導一定時間后，細胞凋亡率開始變化，誘導達24 h后，凋亡細胞增加了6.8%，且短期內隨時間推遲，細胞凋亡率逐漸升高，表明PDCD4可以誘導甲狀腺癌SW579細胞凋亡；加入tPA刺激的甲狀腺癌SW579細胞再加入PDCD4誘導24 h，凋亡增加至15.2%，表明加入tPA刺激的PDCD4誘導的甲狀腺癌SW579細胞凋亡影響較未加入tPA刺激的凋亡效果更明顯，見圖1和圖2。

2.2 甲狀腺癌SW579細胞進入細胞周期情況 檢測甲狀腺癌SW579細胞加入tPA刺激后細胞增殖的情況，結果顯示，處于靜止期的甲狀腺癌SW579細胞加入tPA以后進入細胞周期出現(xiàn)了G2～M期的細胞，見圖3。

2.3 細胞凋亡的細胞周期特異性 PDCD4誘導甲狀腺癌SW579細胞發(fā)生在G1期，PDCD4誘導tPA刺激的甲狀腺癌SW579細胞，細胞周期發(fā)生在G1期，對照組未加PDCD4誘導及tPA刺激幾乎沒有明顯的凋亡發(fā)生。

圖1 PDCD4誘導的甲狀腺癌SW579細胞凋亡散點圖

圖2 PDCD4誘導的tPA刺激的甲狀腺癌SW579細胞凋亡散點圖

圖3 甲狀腺癌SW579細胞刺激后細胞增殖的情況

2.4 細胞周期分析結果 甲狀腺癌SW579細胞處在G0期，tPA刺激之后出現(xiàn)在G0、早/晚G1、S2、G2、M期，加入PDCD4誘導之后CyclinE表達下降，細胞阻滯存在G1期。

2.5 兩組甲狀腺癌SW579細胞中Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達比較 通過PDCD4誘導凋亡對甲狀腺癌SW579細胞的Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達情況比較，觀察組采用PDCD4誘導，對照組未做處理，觀察凋亡相關基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表達，結果顯示觀察組的Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表達值顯著高于對照組，兩組相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，隨著時間延長，觀察組細胞凋亡指數(shù)逐漸升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1和表2。

表1 兩組甲狀腺癌SW579細胞中Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達比較(±s)

表1 兩組甲狀腺癌SW579細胞中Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達比較(±s)

組別mRNA對照組觀察組t值P值Caspase-3 0.82±0.31 1.12±0.56 2.48＜0.05 Caspase-9 0.72±0.26 1.10±0.29 2.62＜0.05

表2 兩組不同時相血清細胞凋亡指數(shù)變化比較(±s)

表2 兩組不同時相血清細胞凋亡指數(shù)變化比較(±s)

注：與3 h比較，aP＜0.05。

組別對照組觀察組t值P值3 h 1.50±0.35 23.84±5.19 24.32＜0.01 6 h 2.64±0.89 42.51±7.24a38.75＜0.01 12 h 2.87±0.43 52.51±8.12a47.36＜0.01 24 h 2.73±0.31 55.48±8.44a51.12＜0.01 F值2.84 74.25 P值0.075＜0.01

3 討論

甲狀腺癌是一種最常見的內分泌腫瘤，近年來發(fā)病率有逐年上升的趨勢，同時甲狀腺癌的治療取得了較快的發(fā)展，但甲狀腺癌的發(fā)病機制目前仍尚不十分明確，PDCD4作為一種新的抑癌基因，其在甲狀腺癌中的表達水平如何？PDCD4對甲狀腺癌有什么樣的作用?能否成為甲狀腺癌治療的新靶點?腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與的復雜過程，腫瘤細胞的生存凋亡與細胞周期有關，細胞周期具有高度的保守性，凋亡不會對正常機體需要的細胞產(chǎn)生威脅，但能夠對不必要的細胞產(chǎn)生景區(qū)的生理調控，凋亡與細胞增殖之間有著潛在相關性，細胞的凋亡具有周期性的特征，往往凋亡的發(fā)生是細胞被阻滯在細胞周期的其中一個時相當中，然而在已有的研究中相關PDCD4誘導的甲狀腺癌SW579細胞凋亡與細胞周期特異性相關的研究尚未涉及，PDCD4是如何通過細胞周期的特異性阻滯而誘導細胞凋亡的，對凋亡相關蛋白Caspase-3、Caspase-9活化有何影響，本文對其凋亡及成瘤的特異性進行了闡述。

筆者在體外對甲狀腺癌SW579細胞株進行培養(yǎng)，在未經(jīng)刺激的情況下，細胞處于G0期的狀態(tài)，當細胞被PDCD4誘導之后，發(fā)生凋亡的細胞較少，細胞不進入細胞周期，而在此基礎上采用甲狀腺癌SW579細胞中組織型纖溶酶原激活劑tPA可以激活甲狀腺癌SW579細胞進入細胞周期，促使細胞增殖，細胞進入了S、G2/M期，細胞凋亡率大大增加了[6-7]?？梢娂毎蛲龅陌l(fā)生只有在進入到細胞中期之后被檢測到。細胞的凋亡是否具有周期特異性，我們通過API的方法進行檢測PDCD4誘導的細胞凋亡情況，在凋亡的早期細胞凋亡出現(xiàn)伴隨著膜外翻的現(xiàn)象，API的方法就是利用AnnexinV與此現(xiàn)象的相結合，通過細胞核染色，對凋亡周期特異性進行判斷，結果顯示，PDCD4誘導的細胞凋亡與周期特異性的凋亡主要發(fā)生在細胞周期的G1期。細胞的周期蛋白是一類在細胞周期中特異性表達的蛋白質，可以通過刺激細胞周期的依賴性蛋白激酶使細胞有特異性周期表現(xiàn)，周期蛋白最大的特點就是時相性，CyclinE/DNA雙標流式細胞術對細胞周期的分析主要是將細胞CyclinE的表達與細胞處的位置結合分析，可以得到細胞的詳細周期信息[8]。CyclinE完全在G1期合成，G0期不會出現(xiàn)CyclinE，其中以晚G1期表達最強，CyclinE可以完全將G0、G1很好地分開，根據(jù)本實驗結果可見PDCD4誘導的細胞凋亡對甲狀腺癌SW579細胞CyclinE的表達是下降的，細胞在G1期被阻滯，此過程也伴隨緩則凋亡相關蛋白Caspase-3、Caspase-9的高表達及活化。

綜上所述，甲狀腺癌SW579細胞在靜止期的時候并沒有啟動周期進程，進入周期后細胞凋亡才會變得敏感，PDCD4誘導凋亡與甲狀腺癌SW579細胞的周期有密切關系，會發(fā)生在特定的時相中，這樣也將細胞凋亡和周期特異性做了一個很好的解釋，從某方面說明了凋亡的周期性。細胞凋亡在惡性腫瘤中具有重要作用，本研究對PDCD4誘導凋亡及抑制成瘤中做了探索性的研究，對腫瘤的誘導凋亡和治療來說有一定的臨床指導意義，希望通過今后進一步動物體內實驗有更多的發(fā)現(xiàn)和收獲。

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Effect of PDCD4 on apoptosis and tumorigenic capacity of SW579 thyroid cancer cells.

XIE Mao-yun,HUANG Yao, YANG Li-tao,WANG Xin-gen.Department of General Surgery,the Eighth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen Uiniversity, Shenzhen 518033,Guangdong,CHINA

Objective To study the mechanism of programmed cell death 4(PDCD4)-induced apoptosis and inhibition of tumorigenic capacity in SW579 thyroid cancer(TC)cells.MethodsSW579 thyroid cancer cells in logarithmic growth phase were divided into two groups.Cells in the observation group were stimulated by PDCD4 apoptosis-related gene Bax for 14 hours and then by tPAfor collection.Cells in the control group did not received stimulation by Bax and tPA.AnnexinV/PI,API markers and Cyclins/DNA flow cytometry were used to check apoptosis and cycle specificity of SW579 cells.RT-PCR was applied to check the activation conditions of Caspase-3,Caspase-9.ResultsSW579 cells of peripheral blood in stationary phase were not sensitive to PDCD4 induction,while those in G1phase showed significant apoptosis under PDCD4 induction.PDCD4-induced apoptosis mainly occurred in the G1phase.The expression levels of Caspase-3,Caspase-9 mRNA in the observation group were(1.12±0.56),(1.10±0.29),which were significantly higher than those in the control group of(0.82±0.31),(0.72±0.26),P＜0.05.ConclusionPDCD4-induced apoptosis of SW579 cells is related to cell cycle,with cycle specificity of cell cycle arrest in G1phase.During the cell cycle arrest,Caspase activation occurred and is involved in the apoptosis and inhibition of tumorigenic capacity.

Programmed cell death 4(PDCD4);SW579 thyroid cancer cell;Apoptosis;Cell cycle;Tumorigenic capacity

R736.1

A

1003—6350（2016）23—3790—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.23.003

2016-06-14)

廣東省深圳市福田區(qū)公益性科研項目(編號：FTWS2014010)

謝茂云。E-mail：xiemaoyun@126.com