符濤，楊擎天，張雅博，石東岳，杜兆杰

(中國(guó)人民解放軍第425醫(yī)院五官科，海南 三亞 572000)

全身應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子在兔下頜骨牽張成骨中的作用

符濤，楊擎天，張雅博，石東岳，杜兆杰

(中國(guó)人民解放軍第425醫(yī)院五官科，海南 三亞 572000)

目的 研究全身應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)促進(jìn)兔下頜骨牽張成骨的作用。方法24只新西蘭白兔按隨機(jī)數(shù)表法分為四組，每組6只，分別為：固定期2周NGF組、固定期2周NaCl組(即空白組)、固定期4周NGF組、固定期4周NaCl組(即空白組)。全麻后雙側(cè)下頜骨行骨劈開并植入牽張器，經(jīng)4 d延遲期，牽引10 d，速度為0.5 mm/12 h。按組別分別給予NGF(0.6μg/d×20 d)和相當(dāng)量生理鹽水(1 mL/d×20 d)肌注。于牽張期10 d及固定期2、4周行X線、HE染色及生物力學(xué)檢測(cè)。結(jié)果X線示：NGF組較空白組牽張區(qū)有更多新骨形成，骨鈣化程度更高；HE染色示：NGF組較空白組新生骨小梁數(shù)量更多，排列更加規(guī)則；生物力學(xué)檢測(cè)示：固定期2周NGF組最大載荷為(12.18±1.65)N、撓曲強(qiáng)度為(11.54±1.27)MPa，均比空白組高25.9%(P＜0.05)；固定期4周NGF組最大載荷為(17.83± 1.92)N、撓曲強(qiáng)度為(16.28±1.74)MPa，均比空白組高14.9%(P＜0.05)。結(jié)論全身注射神經(jīng)生長(zhǎng)因子能促進(jìn)牽張成骨中牽張區(qū)下頜骨的骨再生。

新西蘭白兔；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；牽張成骨；下頜骨

牽張成骨技術(shù)(distraction osteogenesis，DO)技術(shù)是利用牽張應(yīng)力的刺激促進(jìn)牽張區(qū)骨再生的技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于骨畸形、骨缺損等的臨床修復(fù)，但較長(zhǎng)的固定期仍制約著這一技術(shù)的推廣。大量學(xué)者在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，采用局部應(yīng)用重組人骨形成蛋白、富血小板血漿、神經(jīng)生長(zhǎng)因子及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等方法來促進(jìn)成骨，縮短了固定期[1-4]。很多研究發(fā)現(xiàn)，DO中神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)及其受體出現(xiàn)高表達(dá)，NGF能促進(jìn)成骨細(xì)胞向分化并抑制其凋亡，起著直接促進(jìn)成骨的作用，同時(shí)NGF還能促進(jìn)血管的生成，而牽張區(qū)的血管化是成骨的關(guān)鍵，說明NGF也能間接促進(jìn)骨再生[5-7]。NGF還能促進(jìn)外周感覺神經(jīng)的再生，誘導(dǎo)神經(jīng)進(jìn)入骨髓腔，最終促進(jìn)骨再生[8]。以往研究多集中于各種因子的局部應(yīng)用，不可避免會(huì)帶來局部疼痛不適、感染等多種副作用，臨床接受度較低，因此我們考慮采用全身注射的方法。在前期研究中，我們已明確全身注射NGF能促進(jìn)下牙槽神經(jīng)的修復(fù)[9]。本文旨在研究全身注射NGF對(duì)兔下頜骨牽強(qiáng)成骨的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 24只雄性成年新西蘭白兔，購(gòu)自海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，口頜系統(tǒng)無明顯異常，體質(zhì)量2.8～3.2 kg，實(shí)驗(yàn)前普通飲食并適應(yīng)性分籠飼養(yǎng)1周。根據(jù)取材時(shí)間及干預(yù)方法，將兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為四組：A組固定期2周組6只(空白組)：全身注射NaCl；B組固定期2周組6只：全身注射NGF；C組固定期4周組6只(空白組)：全身注射NaCl；D組固定期4周組6只：全身注射NGF。每組牽引速度均為0.5 mm/12 h，牽引長(zhǎng)度為10 mm。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 內(nèi)置式雙側(cè)兔下頜骨鈦合金牽張器購(gòu)自西安中邦鈦生物材料公司(牽張器全長(zhǎng)35 mm，最大牽張距離10 mm，加力螺桿的螺距0.5 mm，固位螺釘直徑1.5 mm，長(zhǎng)7.0 mm)。生長(zhǎng)因子為人胚胎提取神經(jīng)生長(zhǎng)因子，購(gòu)自Abcam公司(粉劑，20μg)，4℃下配置為0.6μg/mL(生理鹽水)。

1.3 牽張器植入手術(shù) 新西蘭白兔術(shù)前30 min肌注青霉素30萬單位。全身麻醉，術(shù)前氯胺酮50 mg/kg肌注，苯巴比妥鈉40 mg/kg靜注，麻醉滿意后，仰臥位固定四肢，頜下三角區(qū)備皮，0.5%碘伏消毒，鋪巾，含1:200 000腎上腺素的1%利多卡因2.5 mL術(shù)區(qū)浸潤(rùn)麻醉。沿頜下三角正中做一約3 cm的縱行切口，切開皮膚、皮下，鈍性分離雙側(cè)下頜下緣，沿下頜骨下緣縱行切開骨膜向頰側(cè)翻瓣，暴露保護(hù)頦神經(jīng)，植入牽張器，雙側(cè)骨劈開。術(shù)中注意保護(hù)下齒槽神經(jīng)血管束，完全固定牽張器，確定骨斷端無移位以避免下牙槽神經(jīng)(IAN)受到下牙槽管斷端的刺激。生理鹽水反復(fù)沖洗，分層嚴(yán)密縫合骨膜、皮下及皮膚。為避免下頜前移后上切牙對(duì)下頜牙齦創(chuàng)傷，將上前牙磨短至原牙冠的一半，并每周調(diào)磨上前牙一次。

1.4 術(shù)后處理及標(biāo)本獲取 兔完全蘇醒后，軟食分籠飼養(yǎng)，嚴(yán)密監(jiān)測(cè)精神、飲食和體重情況。術(shù)后傷口每日清潔消毒并涂紅霉素軟膏2次。術(shù)后青霉素30萬單位/12 h×4 d肌注。術(shù)后按組別給予肌注NGF 0.6μg/d×20 d(總量12μg/只)和生理鹽水1 mL/d×20 d。經(jīng)4 d延遲期，各組均按照0.5 mm/12 h的速度連續(xù)牽張，總距離10 mm。分別于牽張期10 d、固定期2、4周，全麻下雙側(cè)頸總動(dòng)脈置管，4.0%多聚甲醛灌注固定，解剖分離兔雙側(cè)下頜骨標(biāo)本。

1.5 X線、HE染色及生物力學(xué)檢測(cè) 所獲取的雙側(cè)下頜骨從頦部離斷行X線檢查。取雙側(cè)牽張區(qū)組織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)脫鈣、石蠟包埋等處理，硬組織切片機(jī)(DM IRB型，德國(guó)Leica)沿牽張方向?qū)?biāo)本制作為厚5μm切片，行HE染色。金剛砂片切割下頜骨標(biāo)本制備成18 mm×8 mm×2 mm試件，切割時(shí)生理鹽水冷卻，采用萬能電子力學(xué)試驗(yàn)機(jī)(AGS-10kNG，日本SHIMADZ公司)測(cè)定試件在三點(diǎn)彎曲狀態(tài)下的應(yīng)力-應(yīng)變指標(biāo)：試件橫向固定于試驗(yàn)臺(tái)，跨度15 mm，于中點(diǎn)以0.75 mm/min速度勻速加載，直到試件斷裂，X-Y函數(shù)記錄儀記錄應(yīng)力、應(yīng)變曲線，記錄試件破壞時(shí)的最大載荷并測(cè)定各組應(yīng)力-應(yīng)變曲線線性段的斜率、應(yīng)力和應(yīng)變值，計(jì)算撓曲強(qiáng)度(MPa)=3FL/2BH2，其中F為最大載荷值(N)，L為試件跨距(mm)，B為試件寬度(mm)，H為試件高度(mm)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)中及術(shù)后情況 全部實(shí)驗(yàn)兔中，有3只(A，C，D組各1只)牽張區(qū)有膿性分泌物無新生骨質(zhì)，故排除。其余21只均耐受手術(shù)且無術(shù)后感染。實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物體質(zhì)量損失量均低于10%。各組牽張加力時(shí)無明顯阻力。牽張結(jié)束時(shí)，所有兔頦部均明顯前凸。

2.2 X線檢查 牽張器固定在位，牽張區(qū)低密度影，骨折線清晰，骨皮質(zhì)離斷，見圖1。固定期第2周，骨折線模糊，骨皮質(zhì)仍離斷。兩組相比：NGF組牽張區(qū)有較高的鈣化影密度，可見較多新骨填充，見圖2A、2B。固定期第4周，骨折線消失，骨皮質(zhì)連續(xù)，并有少量骨質(zhì)增生，見圖2C、2D。兩組相比：NGF組牽張區(qū)鈣化影密度明顯高于空白組，新生骨量更多，礦化程度更高。

圖1 牽張期10 d

圖2 X線檢查結(jié)果

2.3 HE染色 牽張完成時(shí)，牽張區(qū)內(nèi)充滿大量膠原組織和成骨細(xì)胞，膠原纖維束沿牽張應(yīng)力的方向排列(圖3)。固定期第2周，兩組牽張區(qū)出現(xiàn)幼稚新生骨質(zhì)，沿牽張應(yīng)力方向呈網(wǎng)格狀充滿骨髓腔，新生骨小梁間隙充滿大量新生血管、纖維等結(jié)締組織，成骨細(xì)胞聚集于新生骨小梁周圍(圖4A、4B、4C、4D)。固定期第4周，兩組新生骨小梁均增多，纖維結(jié)締組織減少，骨小梁周圍有大量成骨細(xì)胞分布，排列方向與應(yīng)力一致(圖4E、4F、4G、4H)。不同時(shí)間點(diǎn)，NGF組的新生骨小梁數(shù)量均多于空白組，排列更規(guī)則，融合更加廣泛。牽張區(qū)骨小梁周圍及間隙的成骨細(xì)胞明顯較空白組更加密集。

2.4 生物力學(xué)檢測(cè) 牽張區(qū)新生骨痂的三點(diǎn)彎曲最大載荷和撓曲強(qiáng)度結(jié)果示：NGF組最大載荷及撓曲強(qiáng)度在固定期2周時(shí)均比空白組高25.9%(P＜0.05)，見表1；在固定期4周比空白組高14.9%(P＜0.05)，見表2。

圖3 HE染色牽張期10 d

圖4 HE染色

表1 固定期2周牽張區(qū)新生骨痂三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)(±s)

表1 固定期2周牽張區(qū)新生骨痂三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)(±s)

組別NGF組NaCl組t值P值最大載荷(N) 12.18±1.65 9.03±0.92 11.82 0.017撓曲強(qiáng)度(MPa) 10.27±1.27 7.62±1.08 28.57 0.041

表2 固定期4周牽張區(qū)新生骨痂三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)(±s)

表2 固定期4周牽張區(qū)新生骨痂三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)(±s)

組別NGF組NaCl組t值P值最大載荷(N) 17.83±1.92 15.17±1.58 13.21 0.035撓曲強(qiáng)度(MPa) 15.04±1.74 12.80±1.45 22.96 0.007

3 討 論

針對(duì)牽張成骨技術(shù)固定期過長(zhǎng)的問題，人們局部應(yīng)用多種外源性因子旨在能促進(jìn)DO中新骨生成和新生骨質(zhì)成熟，從而縮短固定期。大量的研究已證實(shí)，局部應(yīng)用如凝血酶受體激活肽(TP508)、hNGF及重組人骨形成蛋白等均能促進(jìn)DO成骨，特別是NGF不僅能促進(jìn)成骨細(xì)胞向分化直接促進(jìn)成骨，而且能促進(jìn)局部組織血管化間接促進(jìn)成骨，同時(shí)能促進(jìn)術(shù)區(qū)外周神經(jīng)的修復(fù)進(jìn)一步促進(jìn)成骨[10-11]。但是也有DO中外源性生長(zhǎng)因子局部應(yīng)用后無效的發(fā)現(xiàn)，其原因可能是由于所選擇因子生物效應(yīng)不同、干預(yù)方法及時(shí)機(jī)等因素所致。目前大多研究均采用局部干預(yù)的方法，可能是考慮到局部應(yīng)用可控性較高，可避免如全身干預(yù)后出現(xiàn)因代謝或流失而無法直接作用靶部位或到達(dá)靶單位目標(biāo)因子濃度過低等所致的效用減低情況，但局部干預(yù)操作復(fù)雜，不可避免會(huì)增加醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)及費(fèi)用，相對(duì)于全身干預(yù)臨床可接受度較低。2006年Fowlkes等[12]在小鼠DO模型中發(fā)現(xiàn)，全身和局部應(yīng)用IGF-1均能明顯的促進(jìn)牽張區(qū)骨質(zhì)的再生和重建，且兩種方法的效果無明顯差別。鑒于DO中NGF和IGF-1相似的表達(dá)規(guī)律，我們推測(cè)全身應(yīng)用NGF也可能促進(jìn)DO成骨。

目前普遍認(rèn)為，神經(jīng)與骨再生關(guān)系密切，其中感覺神經(jīng)促進(jìn)成骨而交感神經(jīng)能抑制成骨[13-15]，在DO中，早期截骨術(shù)和后續(xù)牽張應(yīng)力勢(shì)必會(huì)造成局部的組織血液循環(huán)障礙及缺氧，而延遲下頜骨的同時(shí)也會(huì)對(duì)下齒槽神經(jīng)造成牽拉而導(dǎo)致髓鞘崩解和巨噬細(xì)胞入侵等神經(jīng)損傷，應(yīng)急條件下局部各種內(nèi)源性因子表達(dá)反應(yīng)性明顯增高，內(nèi)源性因子在刺激消除后才逐漸降低至正常水平[5]。因此，筆者認(rèn)為DO固定期更需要外源性因子的介入，但考慮到DO手術(shù)創(chuàng)傷和牽張應(yīng)力會(huì)造成下齒槽神經(jīng)早期和牽張期持續(xù)的損傷，NGF不僅能直接促進(jìn)成骨，而且是神經(jīng)再生修復(fù)的關(guān)鍵因子，同時(shí)參考臨床上治療外周神經(jīng)損傷的時(shí)機(jī)、方法、劑量及療程[16-18]，筆者在DO術(shù)后即持續(xù)給予NGF直到固定期1周，干預(yù)手段我們選用更為方便的肌肉注射，這樣可充分發(fā)揮NGF的生物學(xué)效能。

本實(shí)驗(yàn)中，牽張期結(jié)束時(shí)，牽張區(qū)組織X線檢查未見明顯低密度影，無明顯成骨；固定期2周，牽張區(qū)有彌散鈣化影，新生骨密度明顯低于正常骨質(zhì)，有大量沿應(yīng)力方向分布的纖維組織出現(xiàn)，其間骨基質(zhì)沉積，并有少量細(xì)針狀骨小梁；固定期4周，牽張區(qū)灰度明顯增加，但新生骨質(zhì)密度仍低于正常骨質(zhì)，骨小梁排列尚不規(guī)則，有含哈佛系統(tǒng)的密致骨出現(xiàn)，骨小梁增粗相互連接，有大量成骨細(xì)胞環(huán)繞，同時(shí)破骨細(xì)胞活躍，髓腔區(qū)新生骨部分吸收，骨再生與吸收并存，骨痂改建開始。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，牽張成骨符合膠原纖維增生、間充質(zhì)干細(xì)胞分化、基質(zhì)分泌、纖維骨化，骨小梁融合改建等膜內(nèi)成骨特點(diǎn)，但在部分固定期4周的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)散在軟骨島，類似于軟骨成骨，這可能由于局部低氧環(huán)境，導(dǎo)致干細(xì)胞軟骨向分化有關(guān)。在三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，NGF組新生骨痂的生物力學(xué)強(qiáng)度明顯高于空白組，證明NGF組骨小梁更加的致密成熟。在NGF組和空白組的比較中發(fā)現(xiàn)，NGF組骨小梁體積較大和礦化程度也較高；同時(shí)HE染色示NGF組成骨細(xì)胞的活性更高，骨小梁增粗，而且新生骨小梁數(shù)量更多，相互融合更廣，排列更規(guī)則，也與生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果相符合，均提示全身注射NGF不僅能促進(jìn)新骨生成，而且能促進(jìn)新骨改建。全身注射NGF與局部注射NGF的差異以及聯(lián)合應(yīng)用的效果尚不明確。在實(shí)驗(yàn)中，全身注射NGF所采用的劑量和療程均基本依照臨床應(yīng)用，如何能達(dá)到最佳的干預(yù)效果尚待進(jìn)一步研究。

總之，全身注射人NGF可以促進(jìn)兔下頜骨牽張成骨中新生骨的再生和成熟，結(jié)合全身干預(yù)的優(yōu)點(diǎn)，以期為臨床上縮短牽張成骨固定期提供了一種更為簡(jiǎn)便、有效的輔助治療方法。

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Effect of systemic application of nerve growth factor in rabbit models of mandibular distraction osteogenesis.

FU Tao,YANG Qing-tian,ZHANG Ya-bo,SHIDong-yue,DU Zhao-jie.DepartmentofOphthalmologyand Otorhinolaryngology,No.425 Hospital of Chinese PLA,Sanya 572000,Hainan,CHINA

ObjectiveTo evaluate the ability of systemic application of nerve growth factor(NGF)to enhance callus mineralization in rabbit models of mandibular distraction osteogenesis.MethodsTwenty-four New Zealand white rabbits were randomly divided into 4 groups(each with 6 rabbits):consolidation 2 weeks NGF group,consolidation 2 weeks NaCl group(control group),consolidation 4 weeks NGF group,consolidation 4 weeks NaCl group(control group),under bilateral distraction osteogenesis at a rate of 0.5 mm/12 h for 10 days,with a delay period of 4 d.Immediately after surgery,NGF(0.6μg/d×20 d)and considerable amount of sodium chloride(1 mL/d×20 d)were intramuscularly injected respectively.The rabbits were sacrificed at consolidation time of 2 and 4 weeks for X-ray,histomorphometric and Biomechanical testing.ResultsNGF groups showed higher degree of mineralization and a greater amount of new bone trabeculae in the distracted area.Biomechanical testing showed that the maximum loading and flexural strength of consolidation 2 weeks NGF group were(12.18±1.65)N and(11.54±1.27)Mpa,which were 25.9%higher than those in the control group(P＜0.05),and the maximum loading and flexural strength of consolidation 4 weeks NGF groups were(17.83±1.92)N and(16.28±1.74)Mpa,which were 14.9%higher than those in the control group(P＜0.05).ConclusionSystematic application of NGF can accelerate callus mineralization in distraction osteogenesis.

New Zealand white rabbits;Nerve growth factor;Distraction osteogenesis;Mandible

R-332

A

1003—6350（2016）23—3794—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.23.004

2016-08-25)

海南省三亞市衛(wèi)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào)：2014YW48）

杜兆杰。E-mail：duzhaojie222@aliyun.com