鄭芳芳　朱理敏　高平進(jìn)

200025　上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院高血壓科,上海市高血壓研究所

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體細(xì)胞突變在醛固酮腺瘤發(fā)病中的作用

鄭芳芳朱理敏高平進(jìn)

200025上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院高血壓科,上海市高血壓研究所

【摘要】原發(fā)性醛固酮增多癥是繼發(fā)性高血壓的常見病因，可導(dǎo)致嚴(yán)重的心腦血管病變，影響患者預(yù)后。KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3和CACNA1D基因體細(xì)胞突變通過影響不同的離子穩(wěn)態(tài)，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，從而刺激腎上腺皮質(zhì)球狀帶細(xì)胞分泌過多的醛固酮。該文主要介紹醛固酮腺瘤發(fā)病中上述基因體細(xì)胞突變的作用。

【關(guān)鍵詞】體細(xì)胞突變；原發(fā)性醛固酮增多癥；醛固酮腺瘤；離子通道

原發(fā)性醛固酮增多癥(PA)是一種常見的繼發(fā)性高血壓。由于腎上腺皮質(zhì)球狀帶(ZG)病變，分泌過多的醛固酮，導(dǎo)致水鈉潴留和排鉀增加。在首次確診的高血壓患者中，PA的發(fā)病率約為10%，而在難治性高血壓中可能占到20%。與原發(fā)性高血壓相比，PA患者發(fā)生糖脂代謝異常和心腦血管并發(fā)癥的風(fēng)險更高[4-5]。絕大部分PA患者為散發(fā)型，主要病因是醛固酮瘤(APA)和雙側(cè)腎上腺增生[6-7]。1%~10%的PA患者為家族型醛固酮增多癥(FH)，分為FH-Ⅰ、FH-Ⅱ和FH-Ⅲ型。2011年，作為PA研究的一項突破性進(jìn)展，Choi等報道了KCNJ5基因(編碼內(nèi)向整流鉀通道Kir3.4)突變與APA和FH-Ⅲ的發(fā)病相關(guān),PA的分子生物學(xué)機(jī)制逐漸引起關(guān)注。

1基因突變的發(fā)生率

Choi等通過全基因組測序技術(shù)，首次證實了編碼內(nèi)向整流鉀通道Kir3.4的KCNJ5是APA的致病基因，在22例瑞典APA患者中，2例發(fā)生Gly151Arg突變,6例發(fā)生Leu168Arg突變。對來自英國和澳大利亞的73例散發(fā)型PA患者的研究發(fā)現(xiàn)，26.0%的患者存在Gly151Arg突變，13.7%存在Leu168Arg突變，另有1例少見突變位點delIle157。另一項納入了瑞典、德國、澳大利亞和法國348例PA患者的研究發(fā)現(xiàn)，Gly151Arg和Leu168Arg的突變率分別為24.1%和20.4%，另有2例患者出現(xiàn)少見突變Glu145Gln[10]。來自法國、德國和意大利的474例PA患者中，Gly151Arg和Leu168Arg突變率分別為23.8%和13.7%[11]。總的來說，APA患者的KCNJ5突變率約為40%[12-13]， Gly151Arg和Leu168Arg是突變熱點。

本研究組前期對168例中國APA患者的研究顯示，KCNJ5基因的體細(xì)胞突變率高達(dá)76.8%，其中Gly151Arg和Leu168Arg的突變率分別為39.9%和35.7%，另有Thr158Ala和Thr148-Thr149insArg突變各1例[14]。另一項研究報道,中國APA患者KCNJ5基因突變率為75.4%[15]，與本研究組的結(jié)果接近。另外，中國臺灣地區(qū)和新疆APH患者KCNJ5基因的突變率略低，分別為59.5%和45.7%[16-17]。日本APA患者KCNJ5基因突變率為65.2%[18]。目前，亞洲APA患者的KCNJ5基因突變率普遍高于其他地區(qū)[13]。主要原因可能是種族差異，但仍需多中心研究進(jìn)一步明確。另一方面，不同中心的PA診斷和入選標(biāo)準(zhǔn)存在差異[12-13]。

對KCNJ5野生型合并低鉀血癥的男性PA患者的研究發(fā)現(xiàn)，P型三磷酸腺苷(ATP)酶家族成員ATP1A1基因[編碼鈉離子(Na+)/鉀離子(K+)-ATP酶α亞單位]和ATP2B3基因[編碼細(xì)胞膜鈣離子(Ca2+)-ATP酶]體細(xì)胞突變與APA相關(guān)。德國、法國和意大利的308例APA患者中，有16例(5.2%)ATP1A1突變樣本和5例(1.6%)ATP2B3突變樣本[19]。另有2項國外研究顯示，CACNA1D基因(編碼L-型電壓門控性鈣通道的α1亞單位Cav1.3)體細(xì)胞突變與APA的發(fā)病也存在關(guān)聯(lián)，其突變率分別為15.5%和7.8%[20-21]。

2基因突變與臨床表型

研究顯示，KCNJ5基因體細(xì)胞突變狀態(tài)與APA患者的臨床表型相關(guān)[9-11,14,18-19,22-23]。首先，與野生型患者相比，KCNJ5體細(xì)胞突變在女性中更常見(56.6%對33.3%，P=0.02)。其次，KCNJ5基因突變患者的腺瘤直徑更大(15 mm對11 mm，P=0.021)、尿醛固酮水平更高(23.3 μg/24 h對16.6 μg/24 h，P=0.038)、醛固酮(ng/dL)/腎素[ng/(mL·h)]比值更高(102 對42，P=0.007)，提示醛固酮過度分泌與突變的腺瘤可能存在關(guān)聯(lián)。同時，KCNJ5突變患者的血鉀水平更低(2.6 mmol/L對2.9 mmol/L，P=0.022)[14]。嚴(yán)重的低鉀血癥是PA患者的典型表現(xiàn)之一，因此KCNJ5突變患者更傾向于就診，從而接受PA的篩查。一項納入13項研究、約1 636例APA患者的薈萃分析也顯示，KCNJ5突變患者的血漿醛固酮水平更高、年齡更小、腺瘤更大，且突變多見于女性，亞洲人群長期高鈉飲食可能促進(jìn)KCNJ5突變的發(fā)生[13]。但是，關(guān)于KCNJ5基因突變的研究中，仍缺乏APA患者飲食習(xí)慣的數(shù)據(jù)。另外，KCNJ5突變與手術(shù)預(yù)后的關(guān)系仍不明確[24-25]，需要長期隨訪研究,進(jìn)一步明確。

與KCNJ5突變型和野生型相比，ATP1A1和ATP2B3突變的APA患者多見于男性，且血漿醛固酮水平更高，低鉀血癥更嚴(yán)重[19]。而CACNA1D突變的腺瘤直徑(9 mm)顯著小于KCNJ5突變型(16 mm)和野生型(12 mm)[11]。因此，CACNA1D突變患者易被忽視，可能影響了APA患者中CACNA1D基因突變的檢出率。

3功能學(xué)研究

生理狀態(tài)下，醛固酮由ZG細(xì)胞分泌。以膽固醇作為原料，在一系列特異性酶類的參與下進(jìn)行轉(zhuǎn)換，最終醛固酮合成酶(CYP11B2)催化皮質(zhì)酮轉(zhuǎn)變?yōu)槿┕掏?。高鉀血癥和血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)等因素可刺激醛固酮的產(chǎn)生。在背景內(nèi)向整流鉀通道TASK等因素的作用下，ZG細(xì)胞由靜息狀態(tài)下轉(zhuǎn)為超極化狀態(tài)。Ang Ⅱ與其Ⅰ型受體的結(jié)合，可阻斷這種漏電流及其它鉀通道，引起細(xì)胞膜去極化、電壓門控性鈣通道激活和Ca2+內(nèi)流。細(xì)胞外K+也可直接引起細(xì)胞膜去極化和Ca2+內(nèi)流。同時，Ca2+內(nèi)流可通過激活鈣/鈣調(diào)蛋白激酶信號通路等機(jī)制，引起醛固酮合成限速酶的表達(dá)[26]。另外，慢性Ca2+信號可刺激ZG細(xì)胞增殖。

KCNJ5既可單獨形成同源四聚體，又可與KCNJ3形成活性更強的異源四聚體[27]。Choi等將野生型(WT)或突變型KCNJ5和KCNJ3共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)KCNJ3/KCNJ5WT使細(xì)胞膜超極化，反轉(zhuǎn)電位為(-65±2) mV，且電流可被鋇離子(Ba2+)阻斷，K+與Na+通透比約為(25.3±4.4)∶1。相反，KCNJ3/KCNJ5Gly151Arg和KCNJ3/KCNJ5Leu168Arg均可使細(xì)胞膜去極化，反轉(zhuǎn)電位分別為(0±2)mV和(-5±1) mV，且電流不能被Ba2+阻斷，K+與Na+通透比下降至(1.0±0.1)∶1和(1.3±0.1)∶1。K+通道的GlyTyrGly序列構(gòu)成一個狹窄孔道，可特異性允許K+進(jìn)入細(xì)胞。Gly151是GlyTyrGly序列的第1個甘氨酸。Leu168位于第2個跨膜區(qū)域，側(cè)鏈毗鄰GlyTyrGly序列的酪氨酸側(cè)鏈。選擇性濾器附近的其他體細(xì)胞突變(delIle157[28]、insThr149[29]和Thr148-Thr149insArg[14])也表現(xiàn)出類似的電生理學(xué)特征，不過遠(yuǎn)離選擇性濾器的Trp126Arg突變可間接影響選擇性濾器附近的氨基酸和K+通道選擇性[30]。體外實驗也證實，KCNJ5基因體細(xì)胞突變可促進(jìn)CYP11B2基因mRNA表達(dá)上調(diào)[14,29-30]。總之，KCNJ5突變體可能引起K+通道的選擇性喪失，導(dǎo)致Na+內(nèi)流，細(xì)胞膜去極化，Ca2+通過電壓門控性鈣通道和Na+/Ca2+交換進(jìn)入細(xì)胞，醛固酮合成增加[8,29]。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，G蛋白偶聯(lián)鉀通道阻斷劑tertiapin-Q可阻斷野生型通道的大部分K+電流，而對于突變通道的電流阻斷效果明顯降低。KCNJ5突變體改變了孔道結(jié)構(gòu)形態(tài)，影響tertiapin-Q與離子通道的結(jié)合，這可能是引起Na+通透性異常的普遍機(jī)制[28]。L型鈣通道阻斷劑維拉帕米可抑制突變體部分Na+內(nèi)流，Na+/Ca2+交換體阻斷劑KB-R7943可完全阻斷Na+內(nèi)流[29]。這些藥物是否可抑制醛固酮的自主分泌仍需進(jìn)一步體外實驗證實。

目前，尚無體外實驗研究支持KCNJ5突變可引起細(xì)胞增殖，并且細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載通常引起細(xì)胞凋亡。一項關(guān)于視錐蛋白樣蛋白1(VSNL1)的研究可能有助于解釋為何KCNJ5基因突變患者的腺瘤直徑更大。VSNL1是一種神經(jīng)元鈣感受器蛋白，參與鈣信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。與野生型腺瘤比較，KCNJ5突變型腺瘤的VSNL1表達(dá)增加，可能抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷引起的細(xì)胞凋亡[31]。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，大部分APA患者中Wnt/β-catenin信號通路異常激活，Wnt抑制劑SFRP2可下調(diào)部分患者的Wnt信號，并且抑制APA的形成[32]。該信號通路在APA形成中的作用，及是否與KCNJ5突變存在關(guān)聯(lián)，仍需更深入的研究。

ATP1A1、ATP2B3和CACNA1D突變效應(yīng)與KCNJ5基因突變類似，影響醛固酮的產(chǎn)生。ATP1A1基因的Leu104位于跨膜α螺旋的M1區(qū)，Val332(可能影響Glu334定位)位于M4區(qū)，同時Glu334和Leu104的相互作用可能影響K+與Na+/K+-ATP酶的結(jié)合和門控[19,33-34]。ATP1A1突變可顯著降低ATP酶的活性，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[19]。ATP2B3基因突變Leu425-Val426del和Val426-Val427del通過影響跨膜α螺旋M4的谷氨酸(對應(yīng)于ATP1A1基因的Glu334)，改變Ca2+結(jié)合位點的空間結(jié)構(gòu)[19]。ATP酶突變能引起細(xì)胞膜顯著去極化，激活電壓門控性鈣通道[19]，促進(jìn)CYP11B2和NR4A2的表達(dá)[30]。另外，CACNA1D基因體細(xì)胞突變可引起細(xì)胞膜電位負(fù)值增加，抑制通道失活或增加Ca2+電流，從而激活細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號通路和刺激醛固酮產(chǎn)生[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，作為一種臨床常用的L型鈣通道阻滯劑，氨氯地平可能降低血漿醛固酮水平，影響部分PA患者的診斷[35]。這間接提示調(diào)控Ca2+穩(wěn)態(tài)的相關(guān)基因突變可能影響醛固酮的產(chǎn)生。

4結(jié)語

KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3和CACNA1D基因體細(xì)胞突變通過影響不同的離子穩(wěn)態(tài)，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，從而刺激ZG細(xì)胞分泌過多的醛固酮[36]。Dekkers等[37]研究發(fā)現(xiàn)，ATP1A1和CACNA1D基因突變可同時發(fā)生于同一多結(jié)節(jié)腎上腺內(nèi)，不同結(jié)節(jié)也可發(fā)生KCNJ5基因的不同突變。推測這些突變的發(fā)生晚于腎上腺結(jié)節(jié)的形成，兩個過程并無直接因果關(guān)系。然而，APA患者的這些突變是何時發(fā)生以及如何發(fā)生的，仍需進(jìn)一步探索。目前關(guān)于APA體細(xì)胞突變的研究局限于已切除的腺瘤，探索無創(chuàng)性檢測手段以在術(shù)前確定突變狀態(tài)，將為APA的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

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(收稿：2015-08-11修回：2015-12-07)

(本文編輯：梁英超)

doi:10.3969/j.issn.1673-6583.2016.01.012

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年項目(81500324)

通信作者：高平進(jìn)，Email：gaopingjin@sibs.ac.cn