楊陽(yáng)，林滿洲，黃藝文，陳明

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，廣東 湛江 524001)

香葉木素誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡及周期阻滯的機(jī)制研究

楊陽(yáng)，林滿洲，黃藝文，陳明

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，廣東 湛江 524001)

目的研究香葉木素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、凋亡及周期阻滯的影響并揭示其分子機(jī)制。方法MTT方法檢測(cè)不同濃度香葉木素對(duì)肝癌HepG2的細(xì)胞活力的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度香葉木素處理對(duì)HepG2細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡的作用；Western blot檢測(cè)香葉木素處理對(duì)細(xì)胞p53、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase8、Cleaved-PARP、Bak、cdc2、cyclinB1、p21等細(xì)胞周期調(diào)節(jié)或細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)。結(jié)果香葉木素能顯著抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P＜0.05)；流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期檢測(cè)示：香葉木素處理HepG2細(xì)胞，使G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，而G2/M期細(xì)胞比例顯著升高(P＜0.05)。香葉木素可下調(diào)HepG2細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、cdc2、cyclinB1的蛋白表達(dá)，上調(diào)p53、p21、Bax、Bak,Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase8、Cleaved-PARP等促凋亡蛋白。結(jié)論香葉木素在體外實(shí)驗(yàn)?zāi)芡ㄟ^(guò)激活p53/Bcl-2細(xì)胞凋亡通路抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)通過(guò)上調(diào)p53、p21下調(diào)cdc2、cyclinB1誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M周期阻滯。

香葉木素；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期阻滯；肝癌

肝細(xì)胞癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)肝癌患者多有肝炎肝硬化背景，手術(shù)切除率低，為延長(zhǎng)肝癌患者生存期，化學(xué)藥物治療仍是一個(gè)重要措施，臨床上化療藥物主要是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)消除腫瘤細(xì)胞，其療效過(guò)程中如何與抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的水平有關(guān)。

臨床上合成的化療藥物副作用大，選擇性差，開(kāi)發(fā)新的及強(qiáng)大功效的天然藥物顯得十分重要，本研究中香葉木素(DIOS)是我國(guó)南方藥用植物的有效成分，其主要活性成分為黃酮類化合物，此類物質(zhì)具有抗氧化、抗感染、抗休克等多種作用，目前，有關(guān)研究報(bào)道關(guān)于香葉木素在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面的抗腫瘤作用機(jī)制的文章甚少。本實(shí)驗(yàn)以此為切入點(diǎn)，選擇HepG2細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究香葉木素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期阻滯的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞系HepG2由廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心肝膽外科提供。用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基在5%CO237℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑 香葉木素(Sigma，美國(guó))，AnnexinVFITC/PI細(xì)胞調(diào)亡檢測(cè)試劑盒(BD，美國(guó))，人p53、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase8、Cleav ed-PARP、Bak、cdc2、cyclinB1、p21抗體(CST，美國(guó))，八甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)及碘化丙啶(PI)染液(Sigma，美國(guó))，細(xì)胞蛋白提取試劑盒(碧云天，中國(guó))，PRMI1640培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞增殖檢測(cè)(MTT法) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，消化，計(jì)數(shù)，用10%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)液配制成7.5×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，孵育24 h待細(xì)胞貼壁后加入香葉木素(終藥物濃度分別為0 μg/ml、1 μg/ml、2 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、15 μg/ml、20 μg/ml、25 μg/ml、30 μg/ml)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，設(shè)置對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h，棄上清液，每孔加入100 μl DMSO，振蕩10 min待結(jié)晶充分溶解后在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔吸光度(A)。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率=(對(duì)照組A-試驗(yàn)組A)/(對(duì)照組A-空白組A)×100%

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化 收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組不同濃度香葉木素處理24 h后的HepG2細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)離心5 min，洗滌細(xì)胞，重復(fù)一次。取100 μl細(xì)胞懸液，分別加入5 μl AnnexinV-FITC和PI混勻，避光放置20 min，上機(jī)前加入400 μl緩沖液，混勻后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.3 檢測(cè)細(xì)胞周期的變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG細(xì)胞(4.5×103個(gè)/ml的濃度，3 ml/孔接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后)，對(duì)照組進(jìn)行換液，實(shí)驗(yàn)組給予香葉木素(終濃度分別為0 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml)作用24 h后收集細(xì)胞，離心1 000 r/min×5 min，用預(yù)冷PBS洗滌后用70%乙醇固定過(guò)夜，離心除去乙醇，再用預(yù)冷PBS洗滌，PI染色，4℃避光孵育染色30 min后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相的分布，此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 細(xì)胞周期蛋白p21、cdc2、cyclinB1及凋亡蛋白Bcl-2及Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase8、Cleaved-PARP、Bak蛋白表達(dá)變化的檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，按照細(xì)胞蛋白質(zhì)提取試劑盒的步驟提取細(xì)胞總蛋白，收集細(xì)胞，用BCA法測(cè)定蛋白含量，95℃變性10 min，上20 μg蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將凝膠中分離的蛋白轉(zhuǎn)印PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉2 h后，一抗4℃孵育24 h，二抗37℃孵育2 h，用TBST洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)目的條帶的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，其中兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DIOS對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 倒置相差顯微鏡下觀察到：對(duì)照組細(xì)胞觸角纖細(xì)，生長(zhǎng)旺盛，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞輪廓清晰，大小均一，折光度強(qiáng)，貼壁良好。經(jīng)香葉木素處理后的實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)HepG2細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞形態(tài)變圓，細(xì)胞間隙增大，部分細(xì)胞呈漂浮狀態(tài)或貼壁不牢，細(xì)胞碎片隨濃度的增大而增多，且隨藥物濃度增加，細(xì)胞數(shù)明顯減少，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度香葉木素(0 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、15 μg/ml)處理肝癌HepG2細(xì)胞24 h后光學(xué)顯微鏡觀察

2.2 DIOS對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響 香葉木素能夠抑制HepG2細(xì)胞的活力，且具有時(shí)間濃度依賴性(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 香葉木素作用HepG2細(xì)胞不同時(shí)間的細(xì)胞活力

2.3 DIOS對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響 香葉木素可促使HepG2細(xì)胞凋亡，且隨香葉木素藥物濃度的增加，早期凋亡及晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)逐漸增加且具有一定的濃度依賴性(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度香葉木素作用HepG2細(xì)胞24 h后誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡率

2.4 DIOS對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響 香葉木素可促使HepG2細(xì)胞凋亡，且隨香葉木素藥物濃度的增加，早期凋亡及晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)逐漸增加(P＜0.05)，細(xì)胞周期結(jié)果顯示導(dǎo)致G0/G1期細(xì)胞數(shù)比例降低，G2/M期細(xì)胞數(shù)比例升高，且具有一定的濃度依賴性(P＜0.05)，見(jiàn)圖4。

2.5 DIOS對(duì)HepG2細(xì)胞Bcl-2、Bax、Bad、cdc2、p21、p53、cyclinB1、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase8、Cleaved-PARP蛋白的影響 隨著香葉木素藥物濃度的增加，Bax、Bak、Cleved-capase3、Cleaved-caspase8、Cleaved-PARP、p21、p53蛋白表達(dá)增高，Bcl-2、cyclinB1、cdc2蛋白表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)圖5。

圖4 不同濃度香葉木素對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響

圖5 不同濃度香葉木素作用HepG2細(xì)胞24 h后周期蛋白及凋亡蛋白的表達(dá)

3 討 論

我國(guó)肝癌發(fā)病率高，大多數(shù)患者有肝硬化基礎(chǔ)，約70%的患者失去手術(shù)切除機(jī)會(huì)，故在肝癌綜合治療中化療占據(jù)著重要的地位，目前常用的化療藥物對(duì)肝細(xì)胞肝癌療效欠佳，副作用大，尋求療效好、副作用低的天然藥物具有很重要的科學(xué)與應(yīng)用價(jià)值[1]。

香葉木素存在自然界的草本藥物中，它是我國(guó)南方藥用植物[Striga asiatica(L.)O.Kuntze(玄香科，Scrophulariaceae)]的有效成分，含有香葉木素的Dianthus versicolor Fisch曾作為傳統(tǒng)蒙古藥材用于治療肝細(xì)胞惡性腫瘤等疾病。其主要的藥物活性成分為黃酮類化合物，此類物質(zhì)具有抗活性氧自由基、抗感染、抗腫瘤等多種奇特功效；而香葉木素是較為特殊的一種黃酮類化合物，它含有一種抑制人類肝細(xì)胞CYP1A酶活力的天然黃酮類化合物，具有抗誘變和抗變應(yīng)特性[2]。香葉木素對(duì)于抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究甚少，因此深入研究香葉木素對(duì)腫瘤細(xì)胞的周期阻滯及細(xì)胞凋亡作用機(jī)制為研發(fā)新型抗癌藥物更具有科研意義。

Cdc2(Cyclin-dependent kinases1，CDK1)生物學(xué)上稱為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1，是一個(gè)高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。Cdc2能促使真核細(xì)胞周期G2/M期檢測(cè)點(diǎn)起正性調(diào)節(jié)作用，它與細(xì)胞色素B1(cyclinB1)相互作用形成有絲分裂促進(jìn)因子復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入M期。有研究表明，cyclinA和Cdc2的表達(dá)能抑制cyclinB/Cdc2復(fù)合體的形成，而cyclinB/Cdc2復(fù)合體在細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。而該研究表明香葉木素能下調(diào)Cdc2及cyclinB1的蛋白表達(dá)，從而促使肝癌HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。香葉木素同樣能夠通過(guò)激活p53通路調(diào)控p21周期蛋白的高表達(dá)，而p21周期蛋白能抑制cdc2表達(dá)，從而促使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期[3]。

本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察到香葉木素能夠明顯誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡，且通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明香葉木素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的活力有明顯的抑制作用。而其后的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)香葉木素處理后的肝癌細(xì)胞將進(jìn)一步證明隨著香葉木素藥物濃度的增加與人肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡數(shù)呈正相關(guān)[4]。而實(shí)驗(yàn)最后的Western blot的結(jié)果發(fā)現(xiàn)p53、Bcl-2、Bax、Bak、Cleaved-PARP、Cleavd-caspase8、Cleaved-caspase3高表達(dá)進(jìn)一步證明了香葉能通過(guò)p53/線粒體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

Bcl-2蛋白是Bcl-2原癌基因的編碼產(chǎn)物，是細(xì)胞存活促進(jìn)因子，Bcl-2為細(xì)胞凋亡過(guò)程中的原癌基因之一。Bcl-2蛋白家族參與細(xì)胞線粒體途徑凋亡調(diào)控，Bcl-2蛋白家族可分為凋亡抑制蛋白和促細(xì)胞凋亡蛋白兩大類。其中Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡蛋白，Bax是典型的促細(xì)胞凋亡蛋白，而B(niǎo)ax與Bcl-2相結(jié)合發(fā)揮調(diào)控這細(xì)胞凋亡這一過(guò)程，而本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)香葉木素對(duì)HepG2細(xì)胞的Bcl-2家族蛋白的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)香葉木素能夠通過(guò)線粒體通路誘導(dǎo)Bcl-2蛋白的低表達(dá)，增強(qiáng)Bax凋亡促進(jìn)蛋白的高表達(dá)，且Bax/Bcl-2比值逐漸增大，這一現(xiàn)象進(jìn)一步闡明香葉木素能夠通過(guò)線粒體途徑的Bcl-2蛋白家族誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。

在維持DNA的穩(wěn)定性和完整性的過(guò)程中，PARP (聚二磷酸腺苷核糖聚合酶)是DNA損傷的一個(gè)重要敏感感受器。Caspase-3在正常細(xì)胞內(nèi)以無(wú)活性酶原形式存在于胞漿中，當(dāng)細(xì)胞凋亡程序被激活，形成兩個(gè)小亞基和大亞基，隨之導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。而PARP是細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者，通過(guò)外源性及內(nèi)源性線粒體途徑啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞的最終凋亡也反饋性的激活Caspase-3的表達(dá)。因此，在生物學(xué)上一致認(rèn)為Caspase-3的活化是細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要標(biāo)志。若DNA損傷嚴(yán)重且無(wú)法修復(fù)時(shí)，以底物形式參與凋亡從而誘發(fā)細(xì)胞生物學(xué)的改變[6]。而PARP是通過(guò)Caspase-3的活化來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞的最終凋亡，也是凋亡進(jìn)程中的最后一階段。該研究中發(fā)現(xiàn)香葉木素能隨著濃度的增加促使Cleaved-PARP表達(dá)顯著上升，且在這一過(guò)程中Cleaved-caspase3表達(dá)顯著上升，與Cleaved-PARP的變化一致[7]。

綜上所述，香葉木素通過(guò)p53及線粒體凋亡通路調(diào)控Bcl-2表達(dá)的下調(diào)，上調(diào)Bax、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase8、Cleaved-PARP、Bak，在上述體外實(shí)驗(yàn)證明香葉木素能以時(shí)間-濃度效應(yīng)抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的活力、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，影響細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)從而促使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，促使肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)阻滯。因此，香葉木素是一種潛在的肝癌化療候選藥物，且未來(lái)實(shí)驗(yàn)對(duì)香葉木素如何影響細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)將作進(jìn)一步探討。

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Promoting effect of Diosmetin on the cell cycle arrest and cell apoptosis in HepG2 cell and its mechanism.

YANG Yang,LIN Man-zhou,HUANG Yi-wen,CHEN Ming.Department of Hepatobiliary Surgery,the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo study the effect of Diosmetin on cell proliferation,cell apoptosis and cell cycle arrest in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells,and dissect the underlying mechanism.MethodsMTT assay was performed to detect the viability of HepG2 cells under different levels of Diosmetin.The cell apoptosis rate and cell cycle arrest were analyzed by flow cytometry(FCM).Western blot was applied to measure the protein levels of P53, Bcl-2,Bax,Cleaved-caspase3,Cleaved-caspase8,Cleaved-PARP,Bak,cdc2,cyclinB1,P21.ResultsDiosmetin treatment on HepG2 cells significantly inhibited cell proliferation and induced cell apoptosis(P＜0.05).FCM results showed that Diosmetin treatment significantly promoted cell cycle arrest in G2/M phase in HepG2 cells(P＜0.05),with the proportion of cells in G0/G1phase significantly reduced.Besides,Diosmetin significantly downregulates Bcl-2,cdc2,cyclinB1,and up-regulated Bax,Cleaved-caspase3,Cleaved-caspase8,Cleaved-PARP,Bak,P53,P21.ConclusionDiosmetin inhibits HepG2 cell proliferation and induces cell apoptosis by activation of p53/Bcl-2 pathway.Meanwhile,Diosmetin treatment induces G2/M cell cycle arrest in HepG2 cell by down-regulation of cell cycle related protein cdc2,cyclinB1 and up-regulation of P53,P21.

Diosmetin;Cell apoptosis;Cell cycle arrest;Hepatocellular carcinoma

R735.7

A

1003—6350（2016）03—0354—04

2015-09-05)

陳明。E-mail：fykjk@163.com

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2016.03.004