熊　偉，張曉娟，楊勇琴，張海洋

(1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理671000；2.大理市第一人民醫(yī)院，云南 大理671000)

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云南大理白族人群2型糖尿病患者線粒體基因 A3243G和G3316A點(diǎn)突變的篩查

熊偉1，張曉娟2，楊勇琴1，張海洋1

(1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理671000；2.大理市第一人民醫(yī)院，云南 大理671000)

摘要：目的研究云南大理白族人群2型糖尿病患者線粒體tRNALeu(UUR)基因A3243G突變和NADH脫氫酶亞單位1(ND1)基因G3316A突變的頻率與2型糖尿病發(fā)生的相關(guān)性。方法以隨機(jī)挑取的云南大理白族無血緣關(guān)系的185例糖尿病患者(病例組)和150例健康個(gè)體(對照組)為研究對象，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(PCR-RFLP)進(jìn)行線粒體基因 A3243G和G3316A點(diǎn)突變篩查，并采用χ2檢驗(yàn)，比較線粒體基因突變在兩組間分布的差異，從而得出大理地區(qū)白族人群2型糖尿病與線粒體基因A3243G、G3316A點(diǎn)突變的相關(guān)性。結(jié)果在糖尿病組中A3243G點(diǎn)突變頻率為0.54%(1/185)，在正常對照組未檢出該位點(diǎn)突變；在糖尿病組中G3316A點(diǎn)突變頻率為1.62%(3/185)，正常對照組中該位點(diǎn)突變頻率為0.67%(1/150)。突變頻率在兩組間經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論云南大理地區(qū)白族人群2型糖尿病與線粒體基因 A3243G和G3316A點(diǎn)突變均無相關(guān)性，可能不是該地區(qū)白族人群2型糖尿病的常見遺傳易感因素。

關(guān)鍵詞：2型糖尿?。痪€粒體基因；點(diǎn)突變；云南；白族

(ChinJLabDiagn,2016,20:0189)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是臨床最常見的代謝性內(nèi)分泌疾病之一，具有遺傳易感性，且受到環(huán)境因素和遺傳因素交互作用。其中，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是成人發(fā)病型糖尿病，多在35～40歲之后發(fā)病，占糖尿病患者90%以上。2型糖尿病具有明顯的遺傳異質(zhì)性和母系遺傳傾向。目前認(rèn)為發(fā)病原因是胰島素抵抗(主要表現(xiàn)為高胰島素血癥，葡萄糖利用率下降)和胰島素分泌不足的合并存在，其表現(xiàn)是不均一的，有的以胰島素抵抗為主伴有胰島素分泌不足，有的則是以胰島素分泌不足伴有或不伴有胰島素抵抗[1]。

Ballinger等于1992年首先報(bào)道了線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的10.4kb片段的丟失，導(dǎo)致糖尿病的1個(gè)家系[2]。同年van den Ouweland等發(fā)現(xiàn)另1個(gè)母系遺傳糖尿病伴神經(jīng)性耳聾家系是線粒體的tRNALeu(UUR)基因的異常即第3243位點(diǎn)A→G的點(diǎn)突變引起，二位學(xué)者分別確認(rèn)線粒體基因突變與2型糖尿病之間存在相關(guān)性[3]。1995年項(xiàng)坤三等發(fā)現(xiàn)中國第一例由3243位點(diǎn)突變致糖尿病家系，證實(shí)在我國人群中也同樣存在著線粒體基因突變糖尿病[4]。研究還發(fā)現(xiàn)，線粒體tRNALeu(UUR)基因A3243G突變的糖尿病患者呈不同程度的異質(zhì)性，異質(zhì)程度為32%-63%不等[5]。A3243G突變使得細(xì)胞質(zhì)中ADP/ATP下降，影響胰島β細(xì)胞內(nèi)糖刺激胰島素分泌過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而導(dǎo)致胰島β細(xì)胞分泌功能的減退而導(dǎo)致糖尿病。1995年Nakagawa等報(bào)道人類線粒體NADH脫氫酶亞基1(ND1)基因第3316位點(diǎn)G→A突變與日本人群2型糖尿病的發(fā)生相關(guān)，該位點(diǎn)的突變導(dǎo)致ND1亞單位保守區(qū)域氨基酸的改變，第4位的密碼子由原來編碼非極性氨基酸丙氨酸(GCC)變?yōu)榫幋a極性氨基酸蘇氨酸(ACC)，可能導(dǎo)致線粒體呼吸鏈復(fù)合體I酶活性變化，進(jìn)而影響胰島β細(xì)胞合成和分泌胰島素，促進(jìn)糖尿病的發(fā)生[6]。此后，世界各地陸續(xù)有這2個(gè)基因突變致糖尿病的病例報(bào)道，但不同地區(qū)及不同人群的研究結(jié)果卻不盡相同[7-10]。大量的研究證實(shí)，線粒體基因突變糖尿病是迄今所知患病率最高的單基因突變糖尿病，已經(jīng)被國內(nèi)外學(xué)者公認(rèn)，能以比較快速和簡單的分子生物學(xué)技術(shù)檢出，目前己成為首次進(jìn)入臨床基因診斷的一種糖尿病亞型[11]。

我國糖尿病的發(fā)病率較高，且由于遺傳、經(jīng)濟(jì)、文化和飲食習(xí)慣等原因，少數(shù)民族地區(qū)糖尿病的防控任務(wù)尤為艱巨。白族是我國西南邊疆一個(gè)具有悠久歷史和文化的少數(shù)民族，云南大理地區(qū)是我國白族的主要聚居地之一，經(jīng)濟(jì)文化相對落后，大理白族有食生肉生菜和攝入鹽過多等生活飲食習(xí)慣，其糖尿病延誤診治較多。因此，研究白族人群糖尿病，可以探討糖尿病患者延誤診斷的原因，在少數(shù)民族地區(qū)加強(qiáng)糖尿病知識宣傳，矯正白族人群對糖尿病病變的錯(cuò)誤理解。

以往對云南大理白族人群的人類遺傳學(xué)研究結(jié)果均表明，白族人群的遺傳結(jié)構(gòu)與漢族及其他少數(shù)民族存在一定的差異[12-14]。本研究主要針對大理地區(qū)白族2型糖尿病患者A3243G和G3316A 2個(gè)位點(diǎn)的突變進(jìn)行篩查，旨在揭示大理白族人群2型糖尿病患者與這2個(gè)位點(diǎn)的突變的相關(guān)性，這對該地區(qū)開展具有遺傳傾向性的糖尿病的早期預(yù)防和早期診斷具有重要的理論依據(jù)和指導(dǎo)意義。

1材料與方法

1.1研究材料來源

病例組：根據(jù)WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)確診的2型糖尿病住院病人185例(男98例，女87例)，年齡50-66歲，平均病程8年，體重指數(shù)(23.15±4.02)kg/m2，均為2012年9月至2014年8月于大理市第一人民醫(yī)院住院的患者。對照組：為同期在大理市第一人民醫(yī)院體檢健康的150人(男76人，女74人)，糖耐量正常且無糖尿病家族史，年齡50-63歲，體重指數(shù)(20.56±3.52)kg/m2。兩組人群均選擇云南大理地區(qū)居住的白族人，兩組間性別、年齡和體重指數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上研究個(gè)體之間無血緣關(guān)系，追溯3代均為同一民族個(gè)體，且在云南大理地區(qū)居住3代以上。所有的檢查以及標(biāo)本的收集手續(xù)和過程均按照赫爾辛基宣言要求的原則進(jìn)行，并獲大理大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，嚴(yán)格按照其規(guī)定的程序進(jìn)行，同時(shí)得到患者的知情同意[15]。常規(guī)抽取外周靜脈血，進(jìn)行基因組DNA提取。

1.2基因組DNA提取

取外周靜脈血2-3 ml，加入0.2 ml EDTA- K2抗凝。采用哺乳動(dòng)物全血基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物科技公司)，按照說明書操作，NanoDrop核酸蛋白分析儀測定DNA濃度和純度。

1.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成引物(PAGE級純化，純度99%)。上游引物(Forword)序列為：5′-TTCACAAAGCGCCTTCCCC-3′,下游引物(Reverse)序列為5′-GCGATGGTGAGAGCTA-3′。

PCR反應(yīng)體系為：DNA模板(50 ng/μl) 1 μl，10×PCR buffer 2.5 μl,dNTP 1 μl,Taq DNA 聚合酶(1 U/μl)上PCR反應(yīng)條件為：95℃ 預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95℃變性30 s,58℃ 退火30 s,72℃ 延伸50 s,共循環(huán)35次，最后72℃ 延伸5 min， 4℃ 保存。PCR產(chǎn)物為400 bp的mtDNA片段，對其進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析。

1.4線粒體tRNALeu (UUR)基因A3243G突變的檢測

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl 與10 U的ApaI進(jìn)行酶切反應(yīng)，酶切體系如下：PCR產(chǎn)物5 μl，ApaI(10 U/μl)1 μl，10×buffer L 2 μl,滅菌雙蒸水 12 μl，反應(yīng)總體積為20 μl，37℃ 水浴恒溫 2-3 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯色。A3243G 點(diǎn)突變可使限制性酶ApaI的酶切位點(diǎn)(GGGCC↓C)，酶切產(chǎn)物為90 bp、310 bp的2條條帶，由于該位點(diǎn)突變?yōu)楫愘|(zhì)性突變，故應(yīng)該會(huì)有90 bp、310 bp、400 bp共3條條帶；而野生型沒有ApaI的酶切位點(diǎn)，故電泳只能看到長度為400 bp的1條條帶。根據(jù)電泳圖譜對每個(gè)樣品的基因型進(jìn)行判定。

1.5線粒體ND1基因G3316A突變的檢測

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl與10 U的HaeⅢ進(jìn)行酶切反應(yīng)，酶切體系如下：PCR產(chǎn)物5 μl，HaeⅢ(10 U/μl)1 μl，10×buffer M 2 μl,滅菌雙蒸水12 μl，反應(yīng)總體積為20 μl，37℃水浴恒溫 2-3 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯色。G 33160 A 點(diǎn)突變可使限制性酶HaeⅢ的酶切位點(diǎn)(GG↓CC)消失，野生型有3個(gè)HaeⅢ的酶切位點(diǎn)，電泳結(jié)果理論上應(yīng)出現(xiàn)4條條帶(163 bp、98 bp、15 bp、124 bp)，突變基因型使HaeⅢ的酶切位點(diǎn)消失1個(gè)，電泳結(jié)果應(yīng)為3條條帶(261 bp、15 bp、124 bp)。根據(jù)電泳圖譜對每個(gè)樣品的基因型進(jìn)行判定。

1.62型糖尿病患者臨床資料及生化檢測指標(biāo)收集

記錄病例組和對照組人群的民族、年齡、性別、病程、家族史等情況。測量身高、體重、臀圍、腰圍并計(jì)算體重指數(shù)(BMI)和腰臀比(WHR)。禁食8-10 h后次晨采靜脈血，收集整理研究對象臨床生化檢測的空腹血糖(FBG)、餐后2 h血糖(P2BG)、OGTT 2小時(shí)后血糖水平、糖化血紅蛋白(HbA1C)值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1線粒體DNA片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用合成的引物分別對病例組和對照組樣本的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期目的片段大小為400bp，1.2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增效果良好，與預(yù)期片段大小相符，且沒有非特異性條帶的出現(xiàn)，見圖1。

2.2PCR-RFLP檢測線粒體tRNALeu (UUR)基因A3243G突變

通過PCR-RFLP分析(ApaI/3243)，配制8%的聚丙烯酰胺凝膠，100V穩(wěn)壓電泳約40min，電泳結(jié)束后銀染顯色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：病例組185例大理白族2型糖尿病患者檢出線粒體tRNALeu (UUR)基因A3243G突變的患者有1例，在正常對照組150例中未檢測出A3243G突變，見圖2。

M：Trans2KplusDNAmarker;1-5：線粒體DNA片段的PCR產(chǎn)物(約400bp)

圖1mtDNA片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

M：100bpDNAMaker;1-3:A3243G突變陰性標(biāo)本;4：1:A3243G突變陽性標(biāo)本

圖2線粒體tRNALeu (UUR)基因A3243G突變的RFLP檢測

2.3PCR-RFLP檢測線粒體ND1基因G3316A突變

PCR-RFLP分析(HaeⅢ/3316)結(jié)果表明：病例組185例大理白族2型糖尿病患者檢出線粒體ND1基因A3243G突變的患者有3例，在正常對照組150例檢出突變者1例，見圖3.

M：100bpDNAMaker;1:G3316A突變陰性標(biāo)本 2-4：G3316A突變陽性標(biāo)本

圖3線粒體ND1基因G3316A點(diǎn)突變的RFLP檢測

2.4臨床資料統(tǒng)計(jì)

對所有的研究對象進(jìn)行了相關(guān)臨床數(shù)據(jù)的收集和整理分析，比較2型糖尿病患者中A3243G和G3316A突變攜帶者與非突變攜帶者的主要臨床資料(表1)，發(fā)現(xiàn)其平均發(fā)病年齡、體重指數(shù)(BMI)、腰臀比(WHR)、空腹血糖濃度(FBG)、餐后2h血糖(P2BG)、口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)2小時(shí)后血糖水平、糖化血紅蛋白的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)，還分析了A3243G和G3316A兩個(gè)位點(diǎn)突變在2型糖尿病患者和正常對照組中的分布(表2)，發(fā)現(xiàn)二者的發(fā)生率在兩組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1　突變陽性患者與無突變患者及正常對照組臨床資料的比較

*代表與正常對照組比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；突變陽性組包括A3243G和 G3316A兩個(gè)點(diǎn)突變。

表2　A3243G和G3316A點(diǎn)突變在T2DM

*P>0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3討論

隨著對人類線粒體疾病的深入研究，迄今已發(fā)現(xiàn)與糖尿病相關(guān)的20多種線粒體基因突變位點(diǎn)。常見的突變方式為mtDNA的點(diǎn)突變，均為錯(cuò)義突變，并且具有母系遺傳的特點(diǎn)[16]。其中最常見的突變位點(diǎn)是線粒體tRNALeu(UUR)基因A3243G突變。不同的研究都表明tRNALeu (UUR)基因A3243G突變是一種生物合成性突變，具有明確的致病作用，是線粒體糖尿病中的常見類型[17]。線粒體 tRNA的A3243G突變降低了mtDNA編碼蛋白的穩(wěn)定性和相應(yīng)氨基酸與其tRNA的結(jié)合力，從而影響線粒體蛋白質(zhì)的翻譯。mtDNA 3243位點(diǎn)位于tRNALeu (UUR)基因的雙氫尿嘧啶環(huán)中，此處是16S rRNA和tRNALeu (UUR)基因之間的交界處，也是人類線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子1(human mitochondrial transcription termination factor 1,hMTERF1)的結(jié)合位點(diǎn)[18]。該位點(diǎn)的突變導(dǎo)致與人類線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子1結(jié)合障礙，相鄰rRNA合成減少，影響線粒體氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation,OxPhos)基因翻譯，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP合成不足。

線粒體ND1基因G3316A突變發(fā)生在該基因高度保守區(qū)，為同質(zhì)性錯(cuò)義突變，可導(dǎo)致ND1亞單位上疏水性Ala突變?yōu)橛H水性Thr，可能導(dǎo)致該區(qū)域空間構(gòu)象發(fā)生改變，線粒體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程出現(xiàn)異常，進(jìn)一步導(dǎo)致呼吸鏈復(fù)合體I酶活性降低，細(xì)胞內(nèi)ATP合成減少，降低胰島素合成與分泌誘發(fā)糖尿病[19]。

國內(nèi)外的研究結(jié)果顯示，在隨機(jī)挑選的糖尿病人群中線粒體tRNALen(UUR)基因A3243G突變發(fā)生率為0.5%-1.8%，線粒體ND1基因 G3316A突變發(fā)生率為2.2%-4.0%[20-22]。本研究的結(jié)果顯示在云南大理地區(qū)白族的2型糖尿病人群中A3243G突變的發(fā)生率為0.54%，與國內(nèi)外其他研究報(bào)道的結(jié)果基本吻合，說明此位點(diǎn)的突變率的確很低，不是大理地區(qū)白族2型糖尿病人群發(fā)病的主要原因。本研究還發(fā)現(xiàn)，在云南大理地區(qū)白族2型糖尿病人群中G3316A突變的發(fā)生率為1.62%，且在正常對照組人群中也發(fā)現(xiàn)了0.67%的突變，但兩組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過比較G3316A突變陽性組和突變陰性組的臨床資料發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)突變并沒有影響到糖尿病患者的平均發(fā)病年齡、體重指數(shù)、腰臀比、血糖水平及糖化血紅蛋白水平。因此，我們推測ND1基因G3316A突變在云南大理地區(qū)白族人群中可能僅為mtDNA的基因多態(tài)性，也有文獻(xiàn)報(bào)道G3316A突變只是在其他遺傳和環(huán)境因素的協(xié)同作用下，使機(jī)體對糖尿病的易感性提高[23]。

趙晶等對浙江省溫州地區(qū)156例正常對照個(gè)體和244例2型糖尿病患者A3243G和G3316A兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行突變篩查，結(jié)果表明線粒體基因A3243G 突變在溫州2型糖尿病人群中發(fā)生頻率低，不是該人群2型糖尿病的常見病因，線粒體G3316A在溫州地區(qū)2型糖尿病人群中發(fā)生頻率也低，且在正常人群中存在，可能僅為線粒體基因多態(tài)性[24]。李東等對湖北地區(qū)152例正常對照個(gè)體及134例老年2型糖尿病患者進(jìn)行mtDNA突變分析，G3316A和T3394C點(diǎn)突變率在兩組間有顯著差異，T3593C點(diǎn)突變率在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但未發(fā)現(xiàn)A3243G點(diǎn)突變的存在[25]。徐金瑞等對寧夏地區(qū)回族人群77例健康個(gè)體和63例糖尿病患者的血細(xì)胞mtDNA進(jìn)行突變分析，線粒體基因A3243G、G3316A、T3394C、A3246G、T3593C位點(diǎn)的突變與2型糖尿病發(fā)病均無相關(guān)性[26]。

本研究的結(jié)果表明，在云南大理地區(qū)白族人群中，2型糖尿病與mtDNA的A3243G和G3316A基因突變均無相關(guān)性，可能的原因如下：(1)這兩個(gè)突變位點(diǎn)在不同民族或群體間的頻率分布具有一定的差異性；(2)糖尿病既受遺傳與環(huán)境因素的雙重影響，也與個(gè)體生活方式及所接觸的環(huán)境因素密切相關(guān)；(3)線粒體基因突變存在著個(gè)體異質(zhì)性；(4)研究使用的樣本量仍有限，需進(jìn)一步加大樣本量研究[27]。

糖尿病具有遺傳易感性，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，利用現(xiàn)代分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)手段研究糖尿病使人們對糖尿病的認(rèn)識日益加深。線粒體基因突變糖尿病某些位點(diǎn)的致病突變可能受到遺傳與環(huán)境、組織特異性、異質(zhì)性等因素的影響，從而表現(xiàn)出復(fù)雜的線粒體遺傳疾病特點(diǎn)。對各種線粒體基因突變糖尿病的研究有助于臨床對糖尿病進(jìn)一步分型診治，對指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育也有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值[28]。此外，對線粒體基因突變糖尿病發(fā)病機(jī)制的理解也有助于尋找治療糖尿病的藥物靶點(diǎn)，為將來針對糖尿病的臨床基因治療提供理論依據(jù)和參考資料。

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Detecting of mitochondrial DNA A3243G and G3316A point mutations in patients with type 2 diabetes mellitus in Yunnan Bai minorityXIONGWei1,ZHANGXiao-juan2,YANGYong-qin1,etal.(1.SchoolofBasicMedicalSciences,DaliUniversity,Dali,Yunnan671000,China;2.DaliFirstPeople’sHospital,Dali,Yunnan671000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the prevalence of mitochondrial DNA (mtDNA) dot mutation at position A3243G and G3316A with type 2 diabetes mellitus(T2DM) in Yunnan Bai minority.Methods185 randomly selected,unrelated Yunnan Bai’s patients with T2DM and 150 nondiabetic control individuals without family history of diabetes were examined.The presence of A3243G and G3316A mutations was determined by polymerase chain reaction amplification and restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP).The difference of the mutations in mtDNA with T2DM group and control group were analyzed usingχ2 method.ResultsThe frequency of mtDNA A3243G mutation was 0.54% (1/185) in T2DM group and 0 (0/185) in healthy controls group,and the frequency of mtDNA G3316A mutation was 1.62% (3/185) in T2DM group and 0.67% (1/150) in control group.No statistical differences in the frequencies of mtDNA mutations were found between these two groups.ConclusionNo correlations were found between mutations of mtDNA A3243G,G3316A and T2DM.A3243G and G3316A may be not a major genetic predisposing factor of T2DM patients in Yunnan Bai minority.

Key words:type 2 diabetes mellitus；mitochondrial genes;point mutation;Yunnan;Bai minority

(收稿日期：2015-10-25)

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：R394；Q754

文章編號：1007-4287(2016)02-0189-05

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31260276，81560458)；云南省教育廳科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(2014Z126)；大理學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(BSKY2012018)；云南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目(201408)