杜　飛　李志健　王吉慶　苗　玉

(陜西科技大學(xué)輕工與能源學(xué)院,陜西西安,710021)

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·復(fù)合生物酶·

復(fù)合生物酶制備抗菌紙的研究

杜飛李志健王吉慶苗玉

(陜西科技大學(xué)輕工與能源學(xué)院,陜西西安,710021)

摘要：將葡萄糖氧化酶和溶菌酶單獨及復(fù)配使用，并以表面涂布的方式將其涂布到到紙張表面,使其在紙張表面發(fā)揮最佳抗菌效果,從而得到綠色抗菌紙;通過SEM、TEM及抑菌環(huán)實驗表征抗菌紙的抗菌效果。結(jié)果表明,葡萄糖氧化酶單獨使用,在pH值為6.5時,較佳酶用量范圍為4000～6000 U/g絕干漿；溶菌酶單獨使用，在pH值為5.5時,較佳酶用量為5000～20000 U/g絕干漿。當(dāng)溶菌酶和葡萄糖氧化酶復(fù)配時,葡萄糖氧化酶用量為4000 U/g絕干漿,溶菌酶用量為10000 U/g絕干漿,pH值為6.0時,抗菌紙抑菌效果最好。通過SEM、TEM和抑菌環(huán)分析均表明,兩種酶復(fù)配使用比兩種酶分別單獨使用時,抗菌紙抑菌效果更明顯。

關(guān)鍵詞：復(fù)合生物酶；抗菌紙；抑菌環(huán)

抗菌紙的研究是近幾年來抗菌材料應(yīng)用的一個新領(lǐng)域。目前,賦予紙和紙制品抗菌性能的方法很多,常用的方法是在紙料中加入無機、有機型抗菌劑,可以在一定程度上賦予制備的紙或紙制品一定的抗菌性能[1-3]。目前關(guān)于抗菌紙的研究很多,也取得了許多成果。在食品包裝用抗菌材料方面,Vliemusedre等人[4]在紙料中加入了占纖維量0.5%～1.0%的有機抗菌劑,制備的雞蛋包裝箱紙具有良好的抗菌防霉性能。余成華等人[5]將漆酶催化香草醛接枝殼聚糖作為抗菌劑添加到紙張中，不但有滅菌效果還可以改善紙張性能。Agarwal等人[6]將番茄、青椒、甘藍(lán)和芹菜分別用厚度為0.2 mm的普通包裝紙和厚度為 0.2 mm 的內(nèi)層涂有l(wèi)%殼聚糖乳酸液的包裝紙包裝,測試其在16天儲藏期間生理生化指標(biāo)：失水率、呼吸強度、總糖含量和Vc，結(jié)果表明,用1%殼聚糖乳酸液涂布的包裝紙比用普通包裝紙能更好地儲藏蔬菜,殼聚糖特有的抑制霉菌作用可減少蔬菜受感染機會。劉秉鉞等人[7]采用CuSO4、Na2S2O3和Na2S對聚丙烯腈(俗稱：腈綸)進行改性處理,制備銅系抗菌劑,抗菌劑的加入量為2%時,其72 h抑菌率仍超過90%,隨著抗菌劑加入量的提高,紙張白度下降,裂斷長減少,而撕裂指數(shù)和耐破指數(shù)明顯升高。俄羅斯實用生物技術(shù)研究院在食品包裝材料的聚合物中添加了脫水的酸化物、溶菌酶等物質(zhì)可達(dá)殺滅細(xì)菌,從而改善包裝袋內(nèi)環(huán)境延長保質(zhì)期的目的。在生活用抗菌材料方面,何金星等人[8]發(fā)明了一種有抗菌功能的撲克牌,其制作工藝是在壓光過程使用的油墨中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%～2%的銀系抗菌劑或生物抗菌劑殼聚糖(占油墨質(zhì)量),此種撲克牌的抗菌性可保持兩年。Klofta等人[9]將金屬離子復(fù)合抗菌劑制成抗菌材料加入到紙幣中,可有效殺滅細(xì)菌或抑制細(xì)菌生長,使紙幣“無菌”。在不影響紙幣原有的濕強度、韌性和外觀的前提下,采用物理方法,將抗菌材料加入到紙幣中,運用多重殺菌原理,對紙幣上的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等有害細(xì)菌進行滅殺,殺滅和抑制細(xì)菌可達(dá)99%以上。在醫(yī)用紙基抗菌材料方面,如英國考文垂大學(xué)Manbde等人[10]以某種生物季銨鹽類物質(zhì)為抗菌劑,改善了醫(yī)院員工手的清潔健康,而且它還能幫助防止MRAS病菌傳播。Coma V等人[11]用殼聚糖一銅絡(luò)合物材料制成一次性抗菌紙床單,經(jīng)Quinn抗菌檢測有良好的持久抗菌作用,抗菌紙床單使用1～3天后抑菌率分別為99.5%和92.3%。由上述研究可知,市面上的紙基抗菌材料種類多樣,針對紙基抗菌材料所做的研究也各有側(cè)重,同一類型或不同類型的紙基抗菌材料使用的抗菌劑也有所差別。但是值得注意的是目前紙基抗菌材料的生產(chǎn)和應(yīng)用存在以下2個問題：①紙基抗菌材料的用途有待細(xì)化,市面上缺少針對特殊用途或特殊人群的紙基抗菌材料。如初生體弱嬰兒、化療后免疫力低、對金屬或某種有機物過敏的人群,沒有針對性的抗菌產(chǎn)品。②無機類及有機類紙基抗菌材料很少考慮生產(chǎn)過程中的水污染,而研究證明長期添加無機類及有機類抗菌劑會對造紙過程中循環(huán)白水造成一定的污染,尤其是是金屬離子類抗菌劑。

本研究選用葡萄糖氧化酶和溶菌酶配合使用作為復(fù)合生物酶,該生物酶是一類具有專一催化能力的生物抗菌劑,其對人體完全無害并且在自然界中易降解對環(huán)境不產(chǎn)生任何污染。與傳統(tǒng)的紙基抗菌材料相比，復(fù)合生物酶紙基抗菌材料抗菌效果溫和,抗菌劑綠色無害,其產(chǎn)品特別適用于易敏感人群、體質(zhì)虛弱人群以及嬰幼兒。本實驗以表面涂布的方式將兩種酶涂布到紙張表面,比較兩者單獨使用以及復(fù)配使用時的抗菌效果,進而得出復(fù)合生物酶生產(chǎn)抗菌紙的最佳工藝參數(shù)。

1實驗

1.1原料與儀器

原料與藥品：闊葉木漿板。葡萄糖氧化酶：酶活為50000 U/g、溶菌酶：酶活為30000 U/mg。葡萄糖固體、醋酸、醋酸鈉，均為分析純。葡萄糖溶液(濃度為0.5 mol/L)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的氯化鈉溶液、pH值5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液、pH值6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、pH值6.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液。菌種：大腸桿菌。

儀器：槽式打漿機(ZQS2-23)、纖維解離器(ZQS4)、紙樣抄片器(ZQJ1-B-I)；平板培養(yǎng)皿、接種針、高壓滅菌鍋、接種環(huán)、恒溫恒濕箱(RHP-150AT)、生物培養(yǎng)箱(YX280B)；環(huán)境掃描電鏡SEM(Q45+EDAX Octane Prime)、透射電鏡TEM(FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN)。

1.2實驗方法

1.2.1抗菌紙制備以及抑菌環(huán)測試方法[12]

(1)采用進口闊葉木漿板為原料,在紙樣抄片器中抄造定量為60 g/m2的紙張作為抗菌紙原紙。

(2)利用不同pH值的緩沖溶液、溶菌酶和葡萄糖氧化酶原液,配制一定濃度及不同pH值的溶菌酶和葡萄糖氧化酶溶液。

(3)按每克絕干漿酶活用量及酶溶液的濃度將一定量的酶溶液用玻璃棒均勻涂抹在抗菌紙原紙上,在37℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥,取出后用滅菌后的剪刀剪下直徑為20 mm的紙片,做好標(biāo)記。

(4)采用涂布平板法接種大腸桿菌,再用鑷子將制備好的紙片置于平板培養(yǎng)皿上。

(5)將培養(yǎng)皿置于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

(6)由于酶的抑菌作用會造成抗菌紙周圍大腸桿菌的濃度變化,越接近抗菌紙大腸桿菌濃度越低,這種濃度梯度變化造成其在抑菌紙周圍形成一個顏色較淺的圓環(huán),即為抑菌環(huán)。實驗采用游標(biāo)卡尺通過紙片圓心測量該圓環(huán)的直徑,即為抑菌環(huán)的直徑。

1.2.2大腸桿菌TEM觀察方法[13]

(1)將抑菌環(huán)邊緣的大腸桿菌取出,溶解；

(2)將大腸桿菌在5000 r/min轉(zhuǎn)速下離心分離,并用無菌水洗滌,重復(fù)3次；

(3)采用水與二甲基亞砜(DMSO)作為溶劑,將大腸桿菌分散成一定濃度,并滴到銅網(wǎng)上,進行TEM觀察。

2結(jié)果與討論

2.1溶菌酶制備抗菌紙的抑菌效果研究

在其他抄造條件不變的情況下,改變?nèi)芫冈诩垙堉械挠昧砍炜咕坆1～b5。大腸桿菌經(jīng)過48 h培養(yǎng)后,添加溶菌酶(酶溶液pH值5.5)制備抗菌紙，產(chǎn)生的抗菌效果(抑菌環(huán))如圖1所示,其抑菌環(huán)直徑變化如圖2所示。

圖1　溶菌酶制備抗菌紙的抑菌環(huán)照片

圖3　葡萄糖氧化酶制備抗菌紙的抑菌環(huán)照片

圖2　溶菌酶用量對抗菌紙抑菌環(huán)直徑的影響

由圖1可知,在b1～b5的紙片邊緣均形成了淺色抑菌環(huán),在抑菌環(huán)以及紙面上大腸桿菌生長受到明顯的抑制,說明溶菌酶制備的抗菌紙有一定的抑菌效果。由圖2可以看出,在pH值5.5的條件下,溶菌酶用量在5000～20000 U/g絕干漿時,增加溶菌酶用量紙張的抑菌效果有較為明顯的提高,當(dāng)溶菌酶用量為2500 U/g時，抑菌環(huán)的直徑最大，為25.2 mm。當(dāng)溶菌酶用量超過20000 U/g絕干漿后,增加溶菌酶用量,抗菌紙抑菌效果的變化并不明顯?？紤]抗菌紙的抑菌效果及抑菌成本,溶菌酶的用量不易超過25000 U/g絕干漿。

圖4　葡萄糖氧化酶對抗菌紙抑菌環(huán)直徑的影響

2.2葡萄糖氧化酶制備抗菌紙的抑菌效果研究

在其他抄造條件不變的情況下,改變葡萄糖氧化酶在紙張中的用量抄造抗菌紙p1～p5。大腸桿菌經(jīng)過48 h培養(yǎng)后,添加葡萄糖氧化酶(酶溶液pH值6.5)制備抗菌紙，產(chǎn)生的抗菌效果(抑菌環(huán))如圖3所示,其抑菌環(huán)直徑變化如圖4所示。

如圖3所示,在p1～p5的紙片邊緣均形成了淺色抑菌環(huán),結(jié)合圖2與圖4,從抑菌環(huán)大小來看,p1~p5均不如溶菌酶抗菌紙b1~b5的抑菌效果。說明單獨使用葡萄糖氧化酶做抑菌劑抄造的紙張抑菌效果不如溶菌酶的顯著。分析原因,可能是由于葡萄糖氧化酶的主要抑菌原理為利用紙張周圍的氧氣使紙面上及紙面周圍的好氧菌和微生物由于缺乏氧氣而停止代謝。這是一種以隔絕氧氣為前提的間接抑菌,而溶菌酶的抑菌效果則體現(xiàn)為以細(xì)菌作為作用底物的直接抑菌。從圖4可以看出,在pH值6.5的條件下,其抑菌效果隨葡萄糖氧化酶用量的提高而增加,當(dāng)葡萄糖氧化酶用量為6000 U/g絕干漿時，抑菌環(huán)直徑的最大，為23.2 mm。但當(dāng)葡萄糖氧化酶用量超過5000 U/g絕干漿后,其增加的幅度減緩。因此,考慮抗菌紙的抑菌效果及抑菌成本,葡萄糖氧化酶的用量不易超過6000 U/g絕干漿。

2.3復(fù)合生物酶制備抗菌紙的抑菌效果研究

為了加強抗菌紙的抑菌效果,同時也為了減少抑菌酶的用量,本實驗采用葡萄糖氧化酶和溶菌酶配合(作為復(fù)合生物酶)來抄造紙張,同時發(fā)揮溶菌酶的直接抑菌作用和葡萄糖氧化酶的間接抑菌作用。

表1　正交實驗設(shè)計表

圖5　復(fù)合酶制備抗菌紙的抑菌環(huán)照片(1~9為正交實驗紙樣標(biāo)號)

圖6　抗菌紙紙面及邊緣大腸桿菌SEM、TEM圖

表1為以葡萄糖氧化酶用量、溶菌酶用量以及pH值對抗菌紙抑菌效果影響較大的參數(shù)設(shè)計的3因素3水平的正交實驗表,極差分析及結(jié)果如表2所示。將復(fù)合生物酶作為抑菌劑抄造的抗菌紙接種大腸桿菌后,在生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,產(chǎn)生的抑菌效果如圖5所示。

由表2正交實驗極差分析可知,影響抗菌紙抑菌環(huán)大小的因素主次順序分別為：pH值>溶菌酶用量>葡萄糖氧化酶用量,即pH值是抗菌紙生產(chǎn)過程中抑菌效果的主要影響因素。而考慮3個因素在3水平上的變化,通過均值分析,得出復(fù)合生物酶抗菌紙產(chǎn)生抑菌效果的最佳條件為pH值6.0,溶菌酶用量為10000 U/g絕干漿,葡萄糖氧化酶用量為4000 U/g絕干漿。由上述結(jié)果分析可知,對比前面的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶在單獨使用時抑菌效果不明顯,無法達(dá)到復(fù)合使用時相同的抑菌效果。而由圖2分析可知，如果用溶菌酶單獨抑菌,要達(dá)到相同的抑菌環(huán)直徑26.2 mm,溶菌酶的用量至少要大于25000 U/g絕干漿。結(jié)合正交實驗結(jié)果，通過圖5的觀察,可以發(fā)現(xiàn)用復(fù)合生物酶做抑菌劑生產(chǎn)的抗菌紙抑菌環(huán)效果明顯,抑菌環(huán)邊緣清晰可見,在抑菌內(nèi)部及紙面上基本上看不到大腸桿菌,連抑菌環(huán)的周圍大腸桿菌的密度也較低。說明采用復(fù)合生物酶抄造抗菌紙,比單獨使用效果好。達(dá)到最佳抑菌效果兩種酶的用量比單獨使用時均低。由此可見,溶菌酶和葡萄糖氧化酶復(fù)配使用時不會產(chǎn)生相互抑制,而且還可相互促進,同時發(fā)揮溶菌酶的直接抑菌作用和葡萄糖氧化酶的間接抑菌作用。為了證明兩者的促進抑菌作用,實驗取抑菌環(huán)內(nèi)部紙張做環(huán)境掃描電鏡以及抑菌環(huán)邊緣的大腸桿菌做透射電鏡,結(jié)果如圖6所示。由圖6中SEM圖可知,在抗菌紙表面大腸桿菌的形態(tài)發(fā)生了明顯的彎曲、折疊；部分大腸桿菌的細(xì)胞壁已經(jīng)不再明顯,與周圍的植物纖維相粘連；也有部分大腸桿菌菌體已經(jīng)發(fā)生了斷裂,其殘骸“游離”在紙面纖維上。而由圖6中TEM圖可知在抑菌環(huán)邊緣的大腸桿菌均失去了大部分細(xì)胞壁,部分的大腸桿菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)也不完整。由圖6可知,在抑菌環(huán)內(nèi)部以及邊緣的大腸桿菌均有不同程度細(xì)胞壁破損以及結(jié)構(gòu)不完整,造成這種程度的細(xì)胞損傷一般由氧壓力和外界生物對細(xì)胞侵蝕造成的?？梢娫趶?fù)合生物酶抄造的抗菌紙表面及周圍兩種酶均發(fā)揮了本身的抑菌作用,并有相互促進的效果。

表2　正交實驗極差分析及結(jié)果

3結(jié)論

通過研究可以看出,無論是葡萄糖氧化酶和溶菌酶單獨使用還是二者復(fù)配使用來抄造抗菌紙,均可起到較好的抑菌效果,起到真正綠色抗菌抑菌的作用。

3.1當(dāng)溶菌酶溶液pH值5.5時,溶菌酶較佳用量在5000～20000 U/g絕干漿時,抑菌效果增加明顯,但當(dāng)溶菌酶用量為2500 U/g絕干漿時，抑菌環(huán)直徑的最大，為25.2 mm?？紤]抗菌紙的抑菌效果及抑菌成本,溶菌酶的用量不易超過25000 U/g絕干漿。

3.2單獨使用葡萄糖氧化酶做抑菌劑抄造的紙張抑菌效果不如溶菌酶。當(dāng)葡萄糖氧化酶溶液pH值6.5，其用量為6000 U/g絕干漿時,抑菌環(huán)的直徑最大，為23.2 mm。葡萄糖氧化酶較佳用量為2000~6000 U/g絕干漿。考慮抗菌紙的抑菌效果及抑菌成本,葡萄糖氧化酶的用量不易超過6000 U/g絕干漿。

3.3用葡萄糖氧化酶和溶菌酶配合使用(作為復(fù)合生物酶)做抑菌劑生產(chǎn)的抗菌紙抑菌環(huán)效果最佳。產(chǎn)生最佳抑菌效果條件為：pH值6.0,溶菌酶用量為10000 U/g絕干漿,葡萄糖氧化酶用量為4000 U/g絕干漿。

3.4復(fù)合生物酶抄造的抗菌紙的SEM與TEM的觀察表明，大腸桿菌細(xì)胞損傷是由氧壓力和外界生物對細(xì)胞侵蝕造成的。復(fù)合生物酶抄造的抗菌紙表面及周圍,既發(fā)生了溶菌酶以細(xì)菌為底物直接抑菌作用同時也發(fā)生了葡萄糖氧化酶以氧氣為底物的間接抑菌作用,并且兩者可以相互促進。

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(責(zé)任編輯：董鳳霞)

Manufacture of Antibacterial Paper by Using Combined Enzyme

DU Fei*LI Zhi-jianWANG Ji-qingMIAO Yu

(SchoolofLightIndustryandEnergy,ShannxiUniversityofScience&Technology,Xi’an,ShaanxiProvince,710021)

(*E-mail: dufeilily@126.com)

Abstract：A kind of green antibacterial paper was manufactured by coating glucose oxidase and lysozyme on the paper. Its antimicrobial effect was evaluated through antibacterial annulus test and SEM. The best antimicrobial performance of using glucose oxidase only could be obtained when pH value was 6.5 and enzyme activity was 4000~6000 U/g (on oven dry pulp). And the best antimicrobial effect of using lsozymein only could be obtained when pH value was 5.5 and enzyme activity was 5000~20000 U/g (on oven dry pulp). Antibacterial annulus test and TEM observation showed that the antimicrobial effect of using combined enzyme was better. When using combined enzyme the optimum condition was enzyme activities of 4000 U/g (on oven dry pulp) and 10000 U/g (on oven dry pulp) for glucose oxidase and lysozymein respectively, and pH value was 6.0.

Key words：combined enzyme; antibacterial paper; antibacterial annulus

基金項目：陜西省教育廳科學(xué)研究計劃(14JK1109)。

收稿日期：2015- 09-21(修改稿)

中圖分類號：TS761.6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.11980/j.issn.0254- 508X.2016.02.004

作者簡介：杜飛女士,講師；主要研究方向：造紙生物技術(shù)、生物抗菌材料。