胡義芳，楊朝博，秦松，柳長(zhǎng)柏，鄒黎黎，王君

(1.三峽大學(xué)人民醫(yī)院細(xì)胞治療研究所，湖北 宜昌 443003；2.三峽大學(xué)腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002；3.三峽大學(xué)人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化神經(jīng)科學(xué)&神經(jīng)再生修復(fù)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002)

·綜 述·

金黃色葡萄球菌Sortase A原核表達(dá)純化方法的研究進(jìn)展

胡義芳1，2，楊朝博1，2，秦松1，2，柳長(zhǎng)柏1，2，鄒黎黎1，2，王君1，3

(1.三峽大學(xué)人民醫(yī)院細(xì)胞治療研究所，湖北 宜昌 443003；2.三峽大學(xué)腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002；3.三峽大學(xué)人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化神經(jīng)科學(xué)&神經(jīng)再生修復(fù)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002)

眾所周知，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)轉(zhuǎn)肽酶A(Sortase A)在致病中起著不可或缺的作用，已成為重要研究的靶酶。雖然已有多種實(shí)驗(yàn)方法用于Sortase A的原核表達(dá)純化，但由于缺乏通用的技術(shù)來(lái)得到理想的目的蛋白，因此應(yīng)當(dāng)結(jié)合使用多種方法以降低誤差。對(duì)不同的技術(shù)在金黃色葡萄球菌Sortase A原核表達(dá)過(guò)程的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行比較分析，并針對(duì)性地提出比較理想的解決方案，可為Sortase A作為靶酶的研究提供一些參考。

金黃色葡萄球菌；轉(zhuǎn)肽酶A；原核表達(dá)；純化

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是一種革蘭氏染色陽(yáng)性、凝固酶陰性的葡萄球菌[1]。其作為一種主要的人畜共患病病原體，易引起皮膚軟組織感染、敗血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎、腸炎、腦膜炎、骨髓炎及中毒性休克綜合征等細(xì)菌感染性疾病[2-3]。近年來(lái)的流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，以SA為代表的凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase-negative staphylococci，CoNS)已成為醫(yī)院獲得性感染的一種具有重要臨床意義的主要病原菌[4]。這主要是由于SA對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性很強(qiáng)且其基因組具有高度多態(tài)性和可變性，極易產(chǎn)生對(duì)抗生素的耐藥性導(dǎo)致的[5]。鑒于近年SA耐藥菌株的產(chǎn)生日益增多，甚至出現(xiàn)了多重耐藥，使得臨床工作中可供選擇的藥物越來(lái)越少，急切需要從基因水平去分析這種耐藥現(xiàn)象并找尋新的抗菌靶點(diǎn)，以針對(duì)性的治療SA引起的嚴(yán)重感染。轉(zhuǎn)肽酶A(Sortase A)最初由Mazmanian等[6]于1999年在金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)，是一種廣泛存在于革蘭氏陽(yáng)性菌中的保守的管家基因(Housekeeping gene)[7]。它是一種膜結(jié)合轉(zhuǎn)肽酶，將特定的表面蛋白毒性因子錨定到細(xì)胞壁肽聚糖上，幫助病原菌逃逸宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視[8-9]?？梢?jiàn)Sortase A在SA等革蘭氏陽(yáng)性菌致病過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。目前，已有大量研究表明，Sortase A是一種重要的毒力因子，在其感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如，Gianfaldoni等[10]研究發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌重組Sortase A蛋白免疫小鼠后能抗肺炎鏈球菌感染；Sortase A缺失，病原菌的致病性將會(huì)顯著減弱等[11]。祝令偉等[12]研究發(fā)現(xiàn)，豬鏈球菌2型分選酶srtC5基因敲除突變株的細(xì)胞粘附能力和對(duì)家兔的致病性都顯著降低；王亞男等[13]通過(guò)研究探討發(fā)現(xiàn)蘆丁可能成為Sortase A的潛在抑制劑。因此，Sortase A有望成為新的抗菌靶酶，為日益嚴(yán)重的病原菌耐藥性問(wèn)題提供思路。本文對(duì)不同的技術(shù)在金黃色葡萄球菌Sortase A原核表達(dá)過(guò)程的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行比較分析，并針對(duì)性地提出比較理想的Sortase A的原核表達(dá)純化方法，為轉(zhuǎn)肽酶抑制劑篩選相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì)的研究提供幫助，同時(shí)為相關(guān)疫苗的發(fā)現(xiàn)提供一些參考。

1 轉(zhuǎn)肽酶的生物學(xué)特性

1.1 轉(zhuǎn)肽酶的分類(lèi) 在GeneBank中查詢(xún)可知，轉(zhuǎn)肽酶A幾乎存在于所有的革蘭氏陽(yáng)性菌中，如肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、豬鏈球菌等，且在不同病原菌中其基因數(shù)量不同，功能也有差異。Comfort等[14]對(duì)72種轉(zhuǎn)肽酶相關(guān)基因組序列進(jìn)行比對(duì)，將其分為5個(gè)亞科：SrtA、SrtB、3、4、5，發(fā)現(xiàn)前兩種與SA轉(zhuǎn)肽酶高度同源。后來(lái)又有學(xué)者Dramsi對(duì)61個(gè)轉(zhuǎn)肽酶進(jìn)行分析，建議分為4類(lèi)，即SrtA、SrtB、SrtC、SrtD，且發(fā)現(xiàn)Sortase A為保守的管家基因[15]。目前轉(zhuǎn)肽酶的分類(lèi)法是Dramsi分類(lèi)法。

1.2 Sortase A的結(jié)構(gòu)及功能 Sortase A包含一個(gè)N末端信號(hào)肽和一個(gè)C末端信號(hào)肽。C末端又稱(chēng)為細(xì)胞壁分選信號(hào)(Cell wall sorting signal，CWSS)[16]，由保守氨基酸序列(LPXTG結(jié)構(gòu)域)、一個(gè)疏水區(qū)域和尾部帶電荷的氨基酸殘基組成。Sortase A為Ⅱ型跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，N末端在細(xì)胞內(nèi)，C末端在細(xì)胞外[17]。Sortase A的主要作用是將病原菌的表面蛋白錨定到細(xì)胞壁上，使病原菌逃逸宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，為SA的感染提供條件。首先Sortase A幫助表面蛋白前體在信號(hào)肽存在條件下進(jìn)入分泌系統(tǒng)，使疏水區(qū)和帶電殘基固定膜，然后Sortase A通過(guò)反應(yīng)切斷LPXTG序列中的蘇氨酸與甘氨酸間的肽鍵，最后將蘇氨酸殘基連到細(xì)胞壁上[18]。鑒于SortaseA在革蘭氏陽(yáng)性菌中功能的保守性及重要性，將其作為革蘭氏陽(yáng)性菌抗感染的靶酶，為抗生素耐藥問(wèn)題提供突破口。

2 金葡菌Sortase A基因的幾種原核表達(dá)純化體系研究進(jìn)展

眾所周知，蛋白的原核表達(dá)形式大致有3種：(1)胞外分泌表達(dá)，容易純化且不容易被分解，但一般只有少量的蛋白質(zhì)分泌到胞外；(2)周質(zhì)空間表達(dá)，有利于蛋白的正確折疊和二硫鍵的形成；(3)胞內(nèi)表達(dá)，即包涵體表達(dá)，需要變性復(fù)性等復(fù)雜過(guò)程。為了進(jìn)一步了解Sortase A的免疫原性、功能及作用特點(diǎn)，得到純度高且活性好的Sortase A蛋白，找到適合目的基因表達(dá)的原核表達(dá)載體至關(guān)重要。下面就幾種原核表達(dá)載體表達(dá)的Sortase A相關(guān)蛋白的難易程度及純度活性作分析比較，找出各表達(dá)體系的優(yōu)勢(shì)所在，得到理想的SASortaseA原核表達(dá)純化方法。

2.1 Sortase A在pET22b(+)和pTRX原核表達(dá)載體中的表達(dá)純化 了解到原核表達(dá)載體pET22b(+)攜帶的pelB信號(hào)肽可將蛋白輸送到細(xì)胞質(zhì)空間，周質(zhì)空間的氧化環(huán)境有利于蛋白的正確折疊及二硫鍵的形成[19]；而原核表達(dá)載體pTRX攜帶的分子伴侶硫氧還蛋白(Thioredoxin，TRX)Trx是高度可溶的多肽融合型標(biāo)簽，可增強(qiáng)目的基因在大腸桿菌中的正確折疊，加強(qiáng)目的蛋白的溶解性表達(dá)功能[20]。利用這兩種載體的優(yōu)勢(shì)，羅立新等[21]用金黃色葡萄球菌Sortase A基因組全長(zhǎng)序列分別與原核表達(dá)載體pET22b(+)及pTRX構(gòu)建pET22b-srtA和pTRX-srtA原核表達(dá)序列，得到了以包涵體形式表達(dá)的pET22b-srtA目的蛋白分子量大小為45 kD，表觀分子量與預(yù)期存在差異，可能與其N(xiāo)-末端跨膜區(qū)域有關(guān)；得到的可溶性表達(dá)的pTRX-srtA目的蛋白分子量大小為39 kD。包涵體形式表達(dá)的蛋白，表達(dá)量一般比可溶性形式的高，但包涵體蛋白需要經(jīng)過(guò)變性和復(fù)性等純化過(guò)程，不僅耗時(shí)耗力，還會(huì)導(dǎo)致蛋白生物活性的降低。即使pTRX-srtA是可溶性表達(dá)，但純度和活性仍有待提高。此外，pET22b(+)和pTRX載體上沒(méi)有利于目的蛋白純化和檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)簽，進(jìn)一步增加了純化和檢測(cè)的難度。值得注意的是，鑒于pET22b(+)和pTRX載體的局限性，不能避免目的基因Sortase A的N末端膜錨定序列對(duì)表達(dá)的影響。

2.2 Sortase A在pET32a(+)原核表達(dá)載體中的表達(dá)純化 鑒于pET22b(+)和pTRX原核表達(dá)載體中沒(méi)有利于目的蛋白純化和檢測(cè)的標(biāo)簽，而原核表達(dá)載體pET32a(+)包含多種融合蛋白標(biāo)簽，如六聚組氨酸接頭His-tag、S-tag和硫氧還原蛋白接頭Trx-tag，Trx-tag可增強(qiáng)目的蛋白的可溶性，且大多數(shù)情況下不會(huì)影響被修飾目的蛋白的免疫原性、結(jié)構(gòu)和功能，6*Hi-tag有利于表達(dá)蛋白的純化和檢測(cè)。有研究表明Sortase A基因中N端Srt殘基26～59不具有氨基酸保守性，表達(dá)出的StrAΔn29和StrAΔn59兩種酶具有相似的生物活性[22]，所以N端切除不保守基因序列不會(huì)影響轉(zhuǎn)肽酶的活性?？紤]到SortaseA蛋白包涵體表達(dá)及表達(dá)量不高可能與其N(xiāo)-末端跨膜區(qū)域有關(guān)，所以以含有pET22b-SrtA的質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)合成引物，PCR擴(kuò)增缺失N-末端24個(gè)和59個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)肽酶基因StrAΔn24和StrAΔn59，避免N末端膜錨定序列對(duì)表達(dá)的影響。朱芳等[23]將構(gòu)建好的pET32a-StrAΔn24和pET32a-StrAΔn59轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，分別在最適溫度30℃和28℃及在異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IsopropyI-β-D-thiogalactoside，IPTG)濃度為0.3 mmol/L條件下誘導(dǎo)5 h，得目的蛋白表達(dá)量分別為64.9%和64.2%；用裂解緩沖液(pH 8.0，50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，0.5%TritonX-100)重懸，超聲破碎，得到絕大部分以可溶性形式存在的目的蛋白；將其超聲破碎離心后的上清液上柱(His Trap HP組氨酸標(biāo)記的親和層析柱)，在結(jié)合緩沖液A(pH 8.0，20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/LNaCl，20 mmol/L咪唑)；11%、20%和100%及洗滌緩沖液B(pH 8.0，50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑)的作用下洗脫得到分別為42 kD和37 kD的目的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE及Western免疫印跡(Western blotting)鑒別分析，得到蛋白純度達(dá)95%。在前人的基礎(chǔ)上不斷改進(jìn)和對(duì)目的基因更全面的了解和分析基礎(chǔ)上，可知在避開(kāi)目的基因N末端的膜錨定序列的同時(shí)，用原核表達(dá)載體pET32a(+)得到均以可溶性形式表達(dá)的且生物活性相似的pET32a-StrAΔn24和pET32a-StrAΔn59目的蛋白。載體pET32a(+)中His-tag使目的蛋白的純化和檢測(cè)過(guò)程更易進(jìn)行，更易得到純度更高的目的蛋白。載體pET32a(+)的表達(dá)率較高，表達(dá)量幾乎達(dá)全菌蛋白的三分之二，可得到表達(dá)量高且純度高的目的蛋白。雖然pET32a(+)載體上有相應(yīng)的利于檢測(cè)目的蛋白的標(biāo)簽，但是pET32a-StrAΔn24和pET32a-StrAΔ n59目的蛋白的純化條件不利于蛋白生物活性的保持，對(duì)目的蛋白的活性影響比較大。因此，是否有一種原核表達(dá)體系，使其純化出來(lái)的目的蛋白生物活性更接近于天然蛋白，這樣更有利于進(jìn)行SA Sortase A抑制劑的篩選。

2.3 Sortase A在pGEX-4T-1原核表達(dá)載體中的表達(dá)純化 由于pET32a(+)載體上沒(méi)有利于目的蛋白保持天然生物活性的相關(guān)標(biāo)簽，而pGEX-4T-1載體上含有谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽，融合表達(dá)系統(tǒng)帶有Tac啟動(dòng)子，可在IPTG誘導(dǎo)作用下實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)；外源基因位于GST下游，不會(huì)對(duì)啟動(dòng)子有影響；含有GST標(biāo)簽可用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和層析純化，純化條件比較溫和，使融合蛋白免受胞外蛋白酶的降解，提高了穩(wěn)定性；得到的目的蛋白更接近于天然蛋白，為后續(xù)的酶學(xué)實(shí)驗(yàn)提供了良好的基礎(chǔ)。Sortase A的60～206氨基酸殘基是其催化活性區(qū)域[22]?？紤]到GST標(biāo)簽的優(yōu)勢(shì)，可構(gòu)建GST-SrtAΔn59融合蛋白表達(dá)載體pGEX-SrtAΔn59，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，以期得到純度好活性高的融合蛋白。鄧思等[24]以重組質(zhì)粒pMD20-SrtA為模板，構(gòu)建GST-SrtAΔn59融合蛋白，得到可溶性表達(dá)的相對(duì)分子量大小為42 kD的目的蛋白，表達(dá)量約占菌體總蛋白的40%，經(jīng)親和層析后得到其純度為98%。對(duì)pGEX-SrtAΔn59和pET32a-StrA Δn59兩種融合蛋白表達(dá)載體誘導(dǎo)的純化重組蛋白活性進(jìn)行粗略比較，得知pGEX-SrtAΔn59表達(dá)純化的重組蛋白活性較高。GST標(biāo)簽表達(dá)的目的蛋白表達(dá)率不高，要想得到更多的目的蛋白需要增加工作量。pGEX-4T-1有GST標(biāo)簽，對(duì)相關(guān)的目的蛋白的純化和檢測(cè)提供方便，更容易得到純度高的目的蛋白。純化的條件比較溫和，對(duì)目的蛋白的生物活性影響較小，可以得到更接近于天然蛋白的目的蛋白，活性更高。

綜上可知，pET22b-srtA、pTRX-srtA、pET32a-StrA Δn24、pET32a-StrAΔn59以及pGEX-SrtAΔn59五種表達(dá)體系中，僅pET22b-srtA表達(dá)的目的蛋白是包涵體形式，需要經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性等復(fù)雜過(guò)程，極可能影響最終得到的目的蛋白的活性；其余四種均是以可溶性形式表達(dá)的，純化過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)蛋白的影響也小些；但pET22b-srtA和pTRX-srtA沒(méi)有有效地避開(kāi)Sortase A的N末端膜錨定序列對(duì)表達(dá)的影響，目的蛋白的表達(dá)率不高；而pET32a-StrAΔn24、pET32a-StrAΔn59和pGEX-SrtAΔn59三種體系均沒(méi)有N末端膜錨定序列的影響，表達(dá)率明顯得到了提高，且這三個(gè)表達(dá)體系中都有利于目的蛋白的純化和檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)簽，進(jìn)一步降低了純化和檢測(cè)的難度。pET32a(+)含有6*Hi-tag標(biāo)簽，而pGEX-4T-1載體含有的是GST標(biāo)簽，使pGEX-SrtAΔn59的純化條件更加溫和，得到的目的蛋白更接近于天然蛋白，活性更高。比較理想的金黃色葡萄球菌Sortase A原核表達(dá)純化體系是pGEX-SrtAΔn59，得到了表達(dá)量高、活性好的目的蛋白GST-SrtAΔn59，給尋找SA感染的治療新方法和新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)，如pGEX-SrtAΔn59已用于探索盆腔炎患者感染大腸埃希菌的新靶點(diǎn)及構(gòu)建篩選模型中[25]。生物活性高的蛋白有利于中藥抑制劑的篩選，更有利于對(duì)篩選出的潛在抑制劑進(jìn)行菌體內(nèi)抑制活性的評(píng)價(jià)。同時(shí)可為SrtA抑制劑的發(fā)現(xiàn)和它們之間構(gòu)效關(guān)系的分析奠定基礎(chǔ)。由于單一蛋白的保護(hù)效果并不理想，新一代的蛋白疫苗是預(yù)防SA感染的未來(lái)發(fā)展方向，而我們找出SA較理想的pGEX-SrtAΔn59原核表達(dá)體系可為我們提供表達(dá)量高、活性好的蛋白，可作為多種SA毒力蛋白聯(lián)合免疫，以擴(kuò)大其對(duì)機(jī)體的保護(hù)效應(yīng)，為蛋白抗原聯(lián)合疫苗提供了多種毒力作用的潛在靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。

3 展望

細(xì)菌耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重，給臨床治療帶來(lái)眾多不便。研究顯示革蘭氏陽(yáng)性菌的Sortase A在病原菌致病過(guò)程中起著重要作用，是重要研究的靶酶。本文我們對(duì)SA SortaseA原核表達(dá)純化方法進(jìn)行了全面的分析，并針對(duì)性地提出比較理想的金黃色葡萄球菌Sortase A原核表達(dá)純化方法，為Sortase A酶學(xué)研究提供一些參考。Sortase A的重組蛋白最初是以包涵體形式表達(dá)、表達(dá)量低、純度不高且需經(jīng)過(guò)變性等過(guò)程才能得到；后來(lái)經(jīng)過(guò)以上對(duì)轉(zhuǎn)肽酶的生物學(xué)特性以及Sortase A的幾種表達(dá)載體表達(dá)的融合蛋白的各方面的分析，可知有關(guān)Sortase A目的蛋白的原核表達(dá)在表達(dá)形式、表達(dá)率、純化難易度及生物活性等各有突破點(diǎn)。在以后的研究中可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況選擇相應(yīng)的融合蛋白表達(dá)載體。可為今后研究轉(zhuǎn)肽酶的抑制劑篩選打下良好基礎(chǔ)；可通過(guò)抑制Sortase A相關(guān)表面蛋白的錨定機(jī)理，使病原菌更易被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別消滅，為目前的耐藥性問(wèn)題提供思路；也為今后制備相關(guān)疫苗奠定基礎(chǔ)；Sortase A相關(guān)蛋白可溶性高效表達(dá)可為設(shè)計(jì)成一種促進(jìn)可溶性表達(dá)標(biāo)簽提供思路和依據(jù)。

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Progress on the methods for prokaryotic expression and purification of Staphylococcus aureus Sortase A.

HU Yi-fang1,2,YANG Zhao-bo1,2,QIN Song1,2,LIU Chang-bai1,2,ZOU Li-li1,2,WANG Jun1,3.1.Cell Therapy Research Institute,the People's Hospital of China Three Gorges University,Yichang 443003,Hubei,CHINA;2.Hubei Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapy,China Three Gorges University,Yichang 4430025,Hubei,CHINA;3.Nerve Regeneration&Transformation Laboratory,the People's Hospital of China Three Gorges University,Yichang 443002,Hubei, CHINA

As is well known that Staphylococcus aureus Sortase A plays an essential role in pathogenesis and has become an important target enzyme for research.Although a large number of experimental methods have been applied for the prokaryotic expression and purification of Sortase A,there is no universal method for obtaining the ideal target protein.A variety of methods should be used in conjunction to reduce the errors.This review compares and analyzes the advantages and disadvantages of different methods for prokaryotic expression and purification of Staphylococcus aureus sortase A,and puts forward the ideal solution in order to provide some reference for the research of sortase A as the target enzyme.

Staphylococcus aureus;SortaseA;Prokaryotic expression;Purification

R378.1+1

A

1003—6350（2016）10—1640—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.031

2015-09-11)

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81201766)；湖北省教育廳基金(編號(hào)：Q20151204)；三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院2015-2016年度大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(編號(hào)：2015YCX041)

王君。E-mail：wangjfox@gmail.com；鄒黎黎。E-mail：zoulili@ctgu.edu.cn