王瑞儉 孫鵬 王金玲（北華大學林學院，吉林 吉林 132013）

石油污染微生物修復的生物安全性評價

王瑞儉 孫鵬 王金玲（北華大學林學院，吉林 吉林 132013）

微生物修復是當前石油污染治理的研究熱點，在實際應用中微生物及其石油降解產(chǎn)物可能對生態(tài)環(huán)境造成破壞，對其安全性的研究應引起重視。本文就石油污染微生物修復過程中可能造成二次污染的因素進行分析，通過策略追尋，對微生物降解石油產(chǎn)物的生物安全性研究內(nèi)容及方法進行探討，為微生物修復的生物安全性評估體系的建立提供參考。

石油污染；微生物修復；生物安全性；評價

0 引言

在人類發(fā)展，生產(chǎn)力進步過程中，石油在當代社會發(fā)展中占據(jù)重要位置。在石油開采、儲藏、輸送、提煉、銷售、使用等環(huán)節(jié)都可能發(fā)生泄漏事件，而隨之而來的污染越來越受到公眾關注。石油污染導致土壤、水體等理化結(jié)構發(fā)生變化，引起污染地生態(tài)環(huán)境的改變，直接或間接地對環(huán)境和人類生存造成危害。

1 石油污染的微生物修復技術

石油污染治理早期采用物理方法、化學方法等，因費用高、處理量小、二次污染、可行性等問題目前已經(jīng)少有應用［1］。

微生物修復技術是應用微生物，在適宜的營養(yǎng)及環(huán)境條件下，加快石油污染物降解速度，達到清除土壤中石油污染物的目的。該技術所需處理費用低、效果好、一般不會產(chǎn)物二次污染，被認為是當前污染治理領域最有價值的處理技術。目前發(fā)現(xiàn)100個屬200種微生物可降解石油組分［2，3］。

當前微生物修復研究主要集中在高效降解石油菌株的篩選、降解機制研究、微生物修復實踐［4-6］［7］等方面。

2 石油污染的微生物修復存在問題

應用微生物修復技術治理石油污染面臨著諸多問題。如仍然缺乏降解效果好、適應性強的石油降解菌株；降解石油的機制尚未完全清楚；安全性評價機制尚未建立等。

當前用于石油污染治理的微生物大多是土著微生物。這些微生物多為條件致病菌，經(jīng)過培養(yǎng)后再次投放于環(huán)境中，一般不會對環(huán)境造成嚴重損害。但這些微生物的存在可能影響污染地的微生物群落結(jié)構，影響微生物生態(tài)環(huán)境。另外，投放的微生物降解石油過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也會流入環(huán)境中，這些物質(zhì)將影響周圍環(huán)境的物理性質(zhì)、化學組成等，進而改變當?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境。當前關于外源微生物降解石油產(chǎn)物對污染區(qū)的植物及微生物的生物安全性方面的研究還是空白，也沒有建立起有效的安全性評價機制。

3 提高石油污染微生物修復安全性的策略

微生物修復的最終目的是將石油中有害成份吸收、利用或者轉(zhuǎn)化為低毒、無毒甚至有益的物質(zhì)。保障微生物修復過程的安全性需要考慮到以下方面。

（1）盡量選擇土著微生物進行生物修復 土著微生物對環(huán)境適應性強，安全性好，可以最大限度地降低投放微生物對生態(tài)環(huán)境的破壞作用。在微生物篩選過程中，可以結(jié)合人工誘變技術，通過使用含高濃度石油為培養(yǎng)基等壓力脅迫的方式，誘導土著微生物發(fā)生基因突變，再經(jīng)正向篩選獲得石油降解能力更強的突變菌株，以達到快速修復的目的。

（2）對石油降解微生物的生長特性進行研究 分析微生物對營養(yǎng)、環(huán)境等條件的需求，以保證在投放初期微生物能保持較高的石油降解及生存、繁殖能力，必要時可通過人工馴化等方式提高對投放環(huán)境的適應性。另外，在降解后期，投放的微生物數(shù)量應能迅速降低，以防止對自然的微生物種群結(jié)構造成嚴重破壞，提高投放微生物對環(huán)境的安全性。這一策略在實際中是可能實現(xiàn)的，例如，本課題組篩選出的可高效降解石油的不動桿菌［8］，該菌株在以原油為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代約15次（2天/次）后，其繁殖幾乎完全停滯（未發(fā)表數(shù)據(jù)），將其投放于石油污染環(huán)境中，當繁殖停滯時，衰老細菌將大量死亡，新細菌不能產(chǎn)生而導致菌群數(shù)量迅速降低。

4 石油污染微生物修復的生物安全性評價

用于污染治理的微生物對生態(tài)環(huán)境必須是安全的，因此生物安全性評價是微生物應用于石油污染治理實踐的先決條件。石油污染土壤直接影響植物及微生物，因此其微生物修復的生物安全性應從植物和微生物兩個方面進行。

4.1 對植物生物安全性評價方法

（1）微生物直接投放法：向石油污染地的土壤中投放馴化的微生物，降解土壤中石油組分，對比分析降解前后植物生長態(tài)勢參數(shù)（發(fā)芽率、株高、鮮重、干重、根際重量、根際狀況、葉綠素含量、光合速率等），對其安全性進行評價［9，10］。這是一種直觀有效的方法。

（2）微生物降解產(chǎn)物投放法：在實驗室中完成微生物對石油的降解過程并制備降解產(chǎn)物，再按一定比例加入土壤中，栽種植物后測定植物生長態(tài)勢，對其生物安全性進行評價。受試植物應當對石油有較強的耐受性，能適應石油污染地的環(huán)境，易于檢測各項生理指標，且盡量選用一年生草本植物。與微生物投放法相比，石油降解產(chǎn)物的試驗條件更易于控制，操作性強，誤差小，結(jié)果重現(xiàn)性好，是前期安全性評價的理想方法。

4.2 對微生物的安全性評價方法

（1）微生物直接投放法。方法與植物相似，檢測降解前后石油污染土壤中微生物種群數(shù)量及結(jié)構，與正常土壤對比，可獲得生物安全性信息。微生物種群結(jié)構分析可采用以下方案：①高通量測序法。對微生物宏基因組進行分析，獲得修復前后微生物種群結(jié)構及相對數(shù)量。這是最理想的方案，但操作復雜、技術要求高、分析成本高，不易普及；②定量PCR法。首先選擇部分有代表性菌株，設計并合成相應定量PCR引物，然后提取土壤總DNA，應用定量PCR的方法檢測標志性菌株的相對數(shù)量變化。該方法專業(yè)性強、誤差較大，且對提取的DNA質(zhì)量有較高要求；③脂肪酸分析法。這是一種經(jīng)典的基于GC-MS技術的微生物種群結(jié)構分析方法，要求有相應的大型分析GC-MS儀器；④梯度稀釋-平板計數(shù)法。這也是一種常用的微生物數(shù)量分析方法，缺點是只能對土壤中可培養(yǎng)微生物總數(shù)進行測定，難以對微生物種群進行劃分。

（2）微生物降解產(chǎn)物投放法?？梢圆捎梦⑸锓N群結(jié)構分析（方法同上），也可以應用發(fā)光桿菌對其生物毒性直接進行分析。后者是將石油降解產(chǎn)物加入發(fā)光桿菌培養(yǎng)液中，毒性物質(zhì)的存在將導致發(fā)光桿菌的發(fā)光效率降低，通過測定一定時間內(nèi)發(fā)光強度變化即可對待測物質(zhì)的生物毒性進行分析。該方法是一種直觀、可靠的生物毒性檢測技術，目前已經(jīng)廣泛用于多種毒性物質(zhì)的生物安全性分析［11，12］。

5 結(jié)語

石油污染治理是一個長期的全球性的難題。盡管微生物修復技術具有良好的應用前景，但應用于污染治理實踐還有很長的路要走。在當前建設生態(tài)文明的大前提下，對該技術的生物安全性評價成為關鍵問題之一。本文分析了微生物修復石油污染實踐中可能遇到問題，并對石油微生物修復生物安全性評價的思路與方案進行了深入探討，以期對石油污染微生物治理的實踐提供參考。

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王瑞儉（1970- ），男，漢族，山東運城人，副教授，博士，北華大學林學院，研究方向：環(huán)境科學。

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20130206013SF）.