賈 璇 任連海 席北斗 祝超偉 李鳴曉# 趙由才

(1.北京工商大學食品學院環(huán)境科學與工程系，北京 100048；2.中國環(huán)境科學研究院環(huán)境基準與風險評估國家重點實驗室，北京 100012；3.同濟大學污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海 200092)

水體富營養(yǎng)化導致水生植物大量繁殖，蘆葦是我國濕地、草型湖泊生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在污水凈化和吸附重金屬方面尤為突出[1]。但蘆葦生長末期除部分用作飼料、燃料外，大部分殘體在水中腐解，對水生態(tài)系統(tǒng)造成嚴重危害[2]。蘆葦纖維素、半纖維素等有機質(zhì)含量高[3]，是生物質(zhì)能源化利用的理想原料，氫氣-甲烷聯(lián)產(chǎn)工藝依據(jù)相分離原理，將厭氧發(fā)酵過程分為產(chǎn)氫階段和產(chǎn)甲烷階段，獲得氫氣和甲烷兩種能源，能源轉(zhuǎn)化效率最高可達89%，是實現(xiàn)蘆葦減排產(chǎn)能的重要途徑[4-6]。筆者長期從事有機廢物厭氧聯(lián)產(chǎn)工藝研究[7-8]，由于厭氧聯(lián)產(chǎn)過程復雜，多種微生物相互作用機制不清，微環(huán)境難控，使工藝穩(wěn)定運行困難。產(chǎn)甲烷菌是一類極端厭氧古菌，位于厭氧消化食物鏈的最末端，是厭氧生物處理工藝中最重要的限速步驟，其群落的組成和數(shù)量的變化直接影響厭氧發(fā)酵速率和產(chǎn)氣量[9-10]。

以聚合酶鏈式反應(PCR)擴增為主的非培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展揭示了環(huán)境中龐大的微生物多樣性[11]。PCR—變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)不僅可以研究古菌群落在時間和空間上的動態(tài)變化，還可以通過序列分析或探針雜交確定其中的種群組成[12-13]，對闡明厭氧聯(lián)產(chǎn)過程的微生物作用機制具有重要意義。KEYSER等[14]應用DGGE技術(shù)測定了3種厭氧反應器污泥顆粒中的產(chǎn)甲烷古菌的指紋圖譜，同時對產(chǎn)甲烷古菌進行了鑒定。王慶等[15]采用PCR—DGGE技術(shù)分析了農(nóng)村沼氣池產(chǎn)甲烷古菌的多樣性，其中以甲烷囊菌屬(Methanoculleus)和小甲烷粒菌屬(Methanocorpusculumparvum)為主。目前，已有的研究多集中在研究傳統(tǒng)單相厭氧發(fā)酵工藝中微生物群落變化[16-18]，但采用厭氧聯(lián)產(chǎn)氫氣-甲烷工藝，針對水生植物秸稈開展古菌群落特征及演替規(guī)律的研究還鮮有報道。

本研究以典型水生植物蘆葦為研究對象，采用PCR—DGGE技術(shù)分析氫氣-甲烷聯(lián)產(chǎn)不同階段古菌群落的組成和結(jié)構(gòu)，探討聯(lián)產(chǎn)過程中古菌群落的演替規(guī)律，以期為厭氧發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)的微生物作用機制和生物強化研究提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

蘆葦采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)烏梁素海，蘆葦干樣含碳量33.77%(質(zhì)量分數(shù))，含氮量0.57%(質(zhì)量分數(shù))，總固體(TS)98.68%(質(zhì)量分數(shù))，揮發(fā)性固體(VS)91.39%(質(zhì)量分數(shù))，灰分7.28%(質(zhì)量分數(shù))。接種的厭氧消化污泥含碳量35.20%，含氮量3.06%，TS 16.69%，VS 11.97%，灰分4.72%。取32 g蘆葦干樣，加入10 mg/g纖維素酶R-10浸泡，固液比為1∶12(質(zhì)量比)，48 ℃進行酶解預處理，預處理時間48 h。預處理后的蘆葦樣品接種200 mL厭氧消化污泥，污泥添加量為發(fā)酵總體積的12.5% (體積分數(shù))，培養(yǎng)體積1.6 L，通入高純氮氣5 min以排除反應瓶中的空氣，37 ℃中溫發(fā)酵，攪拌速度150 r/min。采用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)初始pH為5，產(chǎn)氫階段發(fā)酵周期為4 d，分別于0、6、12、24、36、60、96 h采集樣品，編號為H1～H7；待產(chǎn)氫過程結(jié)束，調(diào)節(jié)pH至7，產(chǎn)甲烷階段發(fā)酵周期為18 d，分別于42、66、90、114、162、210、258、306、432 h采集樣品，編號為M1～M9。

1.2 總DNA提取

采用BIOTEKE淤泥基因組DNA快速提取試劑盒提取基因組DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 古菌目的片段擴增

PCR體系：10×Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、引物(10 μmol/L)各1 μL、模板DNA 20～50 ng、Tag聚合酶(Takara，大連)1.5 U、滅菌高純水補齊至50 μL。

擴增條件：采用Touch Down PCR，以增加產(chǎn)物的特異性。反應條件如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，68～58 ℃退火30 s(退火溫度從68 ℃降到58 ℃，每個循環(huán)降低1 ℃，經(jīng)10個循環(huán)后，退火溫度降至58 ℃)，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。用于PCR擴增的引物如表1所示。

1.4 PCR—DGGE分析

1.4.1 PCR產(chǎn)物DGGE

PCR產(chǎn)物用1%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小和濃度。取20 μL PCR產(chǎn)物(約200 ng)與10 μL 5×Loading buffer混勻后進行電泳，以去離子甲酰胺和尿素為變性劑，其中古菌變性梯度為40%～70%，聚丙烯酰胺膠質(zhì)量分數(shù)為8%，電壓20 V預電泳10 min，電壓130 V電泳6 h，溫度恒定為60 ℃。電泳結(jié)束后，凝膠以Gel-Red染色劑染色30 min，洗滌后于Bio-Rad USA上掃描成像分析。

1.4.2 條帶回收及純化

在345 nm波長下將優(yōu)勢差異條帶和共性條帶切下，洗凈后浸泡于裝有高純水的2 mL無菌離心管中，搗碎后加入60 μL TE緩沖溶液，4 ℃放置24 h。取5 μL回收產(chǎn)物作為模板，選用無GC夾的上述PCR擴增的引物，按1.3節(jié)再次擴增。選用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit進行PCR產(chǎn)物回收純化。

表1 用于古菌PCR擴增的引物

圖1 蘆葦厭氧聯(lián)產(chǎn)不同階段累積產(chǎn)氣量和生物氣產(chǎn)量變化情況Fig.1 The maximum cumulative biogas production and proportion from reed under different stages

1.4.3 克隆測序

DNA溶液全量10 μL，加入100 μL JM109感受態(tài)細胞中，再加入890 μL SOC培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)60 min。于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)。取單菌落培養(yǎng)后進行質(zhì)粒提取，采用3730xl測序儀測序，測序結(jié)果提交GenBank并獲得接受號。利用BLAST程序?qū)y序結(jié)果進行同源性分析，獲得相關(guān)種屬的序列信息。

1.5 DGGE圖譜相似性分析

結(jié)合ImageJ、Mathworks Matlab v7.1以及PAST軟件對DGGE圖譜進行分析。首先用ImageJ軟件對DGGE圖譜數(shù)字化，再以Mathworks Matlab v7.1軟件對數(shù)字化DGGE圖譜進行補點處理，最后用PAST軟件選取歐幾里德距離作為參數(shù)進行聚類分析。

1.6 分析方法

累積產(chǎn)氣量采用排水法測定。氫氣和甲烷產(chǎn)量采用SP-6890型氣相色譜儀測定。色譜條件：氫火焰離子化檢測器，色譜柱為3 mm內(nèi)徑不銹鋼填充柱(TDx-01高分子小球)，柱室、汽化室和檢測室的溫度分別為120、150、150 ℃，氬氣為載氣，純度≥99.999%，流速為40 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆葦厭氧聯(lián)產(chǎn)氫氣和甲烷情況

蘆葦秸稈經(jīng)纖維素酶R-10處理后進行厭氧聯(lián)產(chǎn)，結(jié)果如圖1所示。產(chǎn)氫階段初期酶處理組產(chǎn)氣量迅速上升，12 h后產(chǎn)氣量緩慢上升，產(chǎn)氫階段最大累積產(chǎn)氣量為1 360 mL，是未經(jīng)預處理對照組的3倍。酶處理組氫氣體積分數(shù)12 h達到最高，為52.1%，隨著反應進行氫氣體積分數(shù)逐漸降低。產(chǎn)甲烷階段，酶處理組累積產(chǎn)氣量隨時間穩(wěn)定上升，353 h累積產(chǎn)氣量最高達4 400 mL，是對照組的5倍，甲烷體積分數(shù)隨時間顯著上升。對照組最大甲烷體積分數(shù)為68.4%?？梢姡J葦經(jīng)纖維素酶R-10預處理后氫氣和甲烷產(chǎn)量顯著提高。KAPOOR等[19]指出，纖維素酶可特異性地吸附在秸稈的纖維素結(jié)構(gòu)上，促進植物細胞壁溶解，使細胞內(nèi)物質(zhì)溶解出來，并將大分子多糖、蛋白質(zhì)和脂類降解成小分子物質(zhì)，提高了底物利用效率和產(chǎn)氣潛力。

2.2 古菌DGGE圖譜分析

從圖2可以看出，厭氧聯(lián)產(chǎn)不同階段的古菌DGGE條帶種類和分布表現(xiàn)出了明顯的差異，產(chǎn)甲烷階段的古菌種類和數(shù)目明顯高于產(chǎn)氫階段，尤其是產(chǎn)甲烷階段初期表現(xiàn)出了較高的微生物多樣性。條帶7、10、13為兩個階段的共有條帶，貫穿整個厭氧發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)過程，但在兩個階段發(fā)酵過程中各條帶亮度和持續(xù)時間不同。條帶7在產(chǎn)甲烷階段的中后期尤其是泳道M6、M7、M8中亮度高、寬度大和持續(xù)時間長，但在產(chǎn)氫階段亮度低、寬度窄、持續(xù)時間很短。條帶10則在產(chǎn)氫階段和產(chǎn)甲烷初期較為明顯，到產(chǎn)甲烷高峰期逐漸減弱，兩個階段特有的生態(tài)條件為不同微生物的生長創(chuàng)造了適宜的條件，造成了兩個階段優(yōu)勢古菌的差異性。

圖2 古菌DGGE圖譜Fig.2 Archaea DGGE band patterns

條帶2、5分別在產(chǎn)氫階段后期和產(chǎn)氫階段初期出現(xiàn)，為產(chǎn)氫階段的特有條帶，產(chǎn)氫階段末期泳道H7至產(chǎn)甲烷階段，該條帶消失。條帶3、8、12、14、15是產(chǎn)甲烷階段的特有條帶，出現(xiàn)在產(chǎn)氫階段末期和產(chǎn)甲烷階段，為產(chǎn)甲烷階段優(yōu)勢菌群。產(chǎn)甲烷階段，發(fā)酵環(huán)境pH為中性，適宜產(chǎn)甲烷菌生長，使底物中的古菌數(shù)量顯著提高。而條帶4僅出現(xiàn)在產(chǎn)氫階段末期和產(chǎn)甲烷階段初期，即泳道H7和M1～M3?？梢?，隨著蘆葦厭氧聯(lián)產(chǎn)的進行，古菌群落組成發(fā)生了顯著的演替變化，表現(xiàn)在DGGE圖譜上條帶數(shù)目和亮度的規(guī)律性變化。

2.3 古菌群落相似性分析

利用 BIO-RAD QUANTITY ONE 4.6.2軟件處理所得到圖譜，用戴斯系數(shù)(Cs)計算微生物群落的相似性：

Cs = 2j/(a+b)

(1)

式中：j為樣品 A 和 B 共有的條帶數(shù)；a和b分別為樣品 A 和 B 中各自的條帶數(shù)。

Cs取值范圍為0(沒有相同條帶)～1(所有的條帶相同)。依據(jù) Complete Linkage算法對DGGE條帶進行聚類分析。

氫氣-甲烷聯(lián)產(chǎn)不同階段代謝產(chǎn)物的相似性(見表2)和聚類分析(見圖3)表明，相鄰時間的圖譜相似性較高，聚為一類，不同階段代謝產(chǎn)物的圖譜相似性較低。在產(chǎn)氫階段初期，種群結(jié)構(gòu)的Cs最高達94.2(泳道H1、H4)。隨后產(chǎn)氫階段的種群結(jié)構(gòu)Cs均較高，分別為86.8(泳道H1、H2)、79.0(泳道H1、H3)、71.0(泳道H1、H7)?？梢?，產(chǎn)氫階段古菌的微生物群落結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，古菌種類基本保持不變。

表2 基于Cs的相似性矩陣

表3 古菌條帶序列的比對結(jié)果

圖3 古菌DGGE圖譜的聚類分析圖Fig.3 Clustering analysis for DGGE profile of archaea

產(chǎn)甲烷階段中期，也是產(chǎn)甲烷高峰期，種群結(jié)構(gòu)相似性的Cs分別為77.9(泳道M6、M7)、90.9(泳道M6、M8)，產(chǎn)甲烷末期，Cs顯著下降為58.0(泳道M6、M9)，隨著產(chǎn)甲烷的進行，古菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著更替，產(chǎn)氫階段初期和產(chǎn)甲烷階段末期的Cs僅為43.4(H1、M9)。可見，厭氧聯(lián)產(chǎn)過程中古菌的微生物群落組成和功能發(fā)生了規(guī)律性的更替，其中產(chǎn)氫階段古菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高，產(chǎn)甲烷階段古菌群落的微生物多樣性顯著提高。

2.4 古菌群落序列分析

將厭氧聯(lián)產(chǎn)不同階段的古菌條帶進行切膠測序，測序結(jié)果提交到GenBank進行比對，結(jié)果如表3所示。測得的序列條帶與基因庫中已知微生物的同源性比例均在99%以上，經(jīng)BLAST后的古菌序列主要為Methanoculleus、產(chǎn)甲烷古菌(Methanogenicarchaeon)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)和傳統(tǒng)方法不可培養(yǎng)的unculturedMethanosarcinalesarchaeon。其中，Methanogenicarchaeon、Methanoculleushoronobensis等產(chǎn)甲烷菌在厭氧發(fā)酵過程中始終存在，主要通過氫營養(yǎng)途徑合成甲烷。產(chǎn)氫階段的優(yōu)勢古菌為unculturedMethanosarcinalesarchaeon(條帶10)，屬于不可培養(yǎng)微生物，能夠利用乙酸途徑產(chǎn)甲烷，它們通過裂解乙酸，還原甲基碳產(chǎn)生甲烷，同時氧化其羧基碳產(chǎn)生二氧化碳[20]。產(chǎn)氫高峰期，Methanoculleusmarisnigri(條帶2)出現(xiàn)。產(chǎn)氫階段末期到產(chǎn)甲烷階段的過渡期，出現(xiàn)Anaerobicmethanogenicarchaeon(條帶9)，在功能上起著承上啟下的作用。產(chǎn)甲烷高峰期，古菌群落豐富，其中Methanoculleusbourgensis(條帶3)是產(chǎn)甲烷階段的優(yōu)勢微生物[21]。 SONG等[22]也從秸稈和畜禽糞便混合厭氧消化系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了Methanosarcina、Methanosaeta、Methanoculleus等6類產(chǎn)甲烷菌。

3 結(jié) 論

采用PCR—DGGE技術(shù)，研究了蘆葦厭氧發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)氫氣-甲烷過程中古菌群落組成和演替規(guī)律。隨著蘆葦厭氧聯(lián)產(chǎn)的進行， DGGE圖譜上條帶數(shù)目和亮度的規(guī)律性變化，群落相似性和聚類分析表明，相鄰時間的圖譜相似性較高，聚為一類，不同階段代謝產(chǎn)物的圖譜相似性較低，厭氧聯(lián)產(chǎn)過程中古菌的微生物群落組成和功能發(fā)生了規(guī)律性的更替，其中產(chǎn)氫階段古菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高，產(chǎn)甲烷階段古菌群落的微生物多樣性顯著提高。

序列分析表明，厭氧聯(lián)產(chǎn)氫氣-甲烷過程中存在古菌主要有Methanoculleus、Methanogenicarchaeon、Methanobacterium和unculturedMethanosarcinalesarchaeon等。產(chǎn)氫階段的優(yōu)勢古菌為unculturedMethanosarcinalesarchaeon，能夠利用乙酸途徑產(chǎn)甲烷。產(chǎn)氫高峰期，出現(xiàn)Methanoculleusmarisnigri。產(chǎn)氫階段末期到產(chǎn)甲烷的過渡期，出現(xiàn)Anaerobicmethanogenicarchaeon，在功能上起著承上啟下的作用。產(chǎn)甲烷高峰期，古菌群落豐富，Methanoculleusbourgensis是產(chǎn)甲烷階段優(yōu)勢菌。

[1] 何娜,張玉龍,孫占祥,等.水生植物修復氮、磷污染水體研究進展[J].環(huán)境污染與防治,2012,34(3):73-78.

[2] 曹培培，劉茂松，唐金艷，等.幾種水生植物腐解過程的比較研究[J].生態(tài)學報,2014,34(14):3848-3858.

[3] 朱靜,吳亦紅,李洪波,等.白洋淀蘆葦資源化利用技術(shù)及示范研究[J].環(huán)境科學與技術(shù),2014,37(增刊2):92-94.

[4] XIE Binfei,CHENG Jun,ZHOU Junhu,et al.Cogeneration of hydrogen and methane from glucose to improve energy conversion efficiency[J].Int. J. Hydrogen Energ.,2008,33(19):5006-5011.

[5] ZHAO Mingxing,RUAN Wenquan.Improving hydrogen generation from kitchen wastes by microbial acetate tolerance response[J].Energ. Convers and Manage.,2014,77:419-423.

[6] FOUNTOULAKIS M S,MANIOS T.Enhanced methane and hydrogen production from municipal solid waste and agro-industrial by-products co-digested with crude glycerol[J].Bioresource Technol.,2009,100(12):3043-3047.

[7] JIA Xuan,LI Mingxiao,XI Beidou,et al.Integration of fermentative biohydrogen with methanogenesis from fruit-vegetable waste using different pre-treatments[J].Energ. Convers and Manage.,2014,88:1219-1227.

[8] 楊洋,夏天明,祝超偉,等.預處理方法對香蒲厭氧發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)H2-CH4效能的研究[J].環(huán)境科學研究,2014,27(2):57-64.

[9] 公維佳,李文哲,劉建禹.厭氧消化中的產(chǎn)甲烷菌研究進展[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2006,37(6):838-841.

[10] 方曉瑜,李家寶,芮俊鵬,等.產(chǎn)甲烷生化代謝途徑研究進展[J].應用與環(huán)境生物學報，2015,21(1):1-9.

[11] 梅冰,彭緒亞,謝影.采用RT-PCR法解析餐廚垃圾厭氧消化微生物群落多樣性[J].環(huán)境污染與防治,2015,37(8):26-30.

[12] 朱建林,詹鵬,呂文洲.聚合酶鏈反應—變性梯度凝膠電泳技術(shù)研究梯田式人工濕地微生物群落動態(tài)變化[J].環(huán)境污染與防治,2010,32(2):46-50.

[13] MYERS R M, FISCHER S G, LERMAN L S,et al.Nearly all single base substitutions in DNA fragments joined to a GC-clamp can be detected by denaturing gradient gel electrophoresis[J].Nucleic Acids Res.,1985,13(9):3131-3145.

[14] KEYSER M,WITTHUHN R C,LAMPRECHT C,et al.PCR-based DGGE fingerprinting and identification of methanogens detected in three different types of UASB granules[J].Syst. Appl. Microbiol.,2006,29(1):77-84．

[15] 王慶，阮志勇，高立洪，等.基于mcrA克隆文庫和PCR-DGGE技術(shù)對牛糞為原料的農(nóng)村戶用沼氣池產(chǎn)甲烷古菌的多樣性研究[J].中國沼氣,2012,30(3):3-13.

[16] HESHAM A E,QI R,YANG M.Comparison of bacterial community structures in two systems of a sewage treatment plant using PCR-DGGE analysis[J].J. Environ. Sci.,2011,23(12)：2049-2054.

[17] 趙丹,余瑞彰,李秀艷,等.厭氧暗發(fā)酵產(chǎn)氫細菌研究進展[J].環(huán)境污染與防治,2009,31(1):78-82.

[18] KUNDU K,SHARMA S,SREEKRISHNAN T R.Effect of operating temperatures on the microbial community profiles in a high cell density hybrid anaerobic bioreactor[J].Bioresource Technol.,2012,118(8):502-511.

[19] KAPOOR M,RAJ T,VIJAYARAJ M.Structural features of dilute acid,steam exploded,and alkali pretreated mustard stalk and their impact on enzymatic hydrolysis[J].Carbohyd.Polym.,2015,124:265-273.

[20] LIU Yuchen,WHITMAN W B.Metabolic,phylogenetic,and ecological diversity of the methanogenic archaea[J].Annals of the New York Academy of Sciences,2008,1125(1):171-189.

[21] JAENICKE S,ANDER C,BEKEL T,et al.Comparative and joint analysis of two metagenomic datasets from a biogas fermenter obtained by 454-pyrosequencing[J].PLoS One,2011,6(1):e14519.

[22] SONG Zilin,ZHANG Chao.Anaerobic codigestion of pretreated wheat straw with cattle manure and analysis of the microbial community[J].Bioresource Technol.,2015,186:128-135.