曹洪勛，孫宇峰，宋鑫玲，李秋芝，姜籽竹（黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶163319）

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亞麻子房整體染色透明、切片技術(shù)的優(yōu)化

曹洪勛，孫宇峰，宋鑫玲，李秋芝，姜籽竹
（黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶163319）

摘要：本文通過(guò)整體染色透明技術(shù)與石蠟切片技術(shù)相結(jié)合的方法，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室操作，對(duì)亞麻子房石蠟切片方法進(jìn)行總結(jié)，旨在解決因缺少觀察設(shè)備而無(wú)法進(jìn)行觀測(cè)和組織觀察后樣品無(wú)法長(zhǎng)期保存的缺點(diǎn)，為科研工作者提供方法支持，減少摸索時(shí)間。

關(guān)鍵詞：石蠟切片；整體染色透明技術(shù)；亞麻子房

整體染色透明技術(shù)由赫爾提出，適合觀察多種植物的胚珠和胚囊［1］。克蘭運(yùn)用另一種透明劑水楊酸甲酯(即冬育油)，其透明效果超過(guò)，可用于胚珠、子房的透明。施特利等通過(guò)梅氏蘇木精明礬染色和冬青油透明觀察，這樣彌補(bǔ)了單純用透明法反差太小的缺點(diǎn)，擴(kuò)大了應(yīng)用范圍。在這基礎(chǔ)上，楊弘遠(yuǎn)提出效果更好的“愛氏蘇木精染色一冬育油透明”新程序，對(duì)材料有更廣泛的適應(yīng)性［2］。20世紀(jì)80年代，中國(guó)許多學(xué)者以水稻多胚苗為材料，研究無(wú)融合生殖，該技術(shù)成功應(yīng)用于多胚苗的胚胎學(xué)觀察。此外，劉向東等將“愛氏蘇木精染色一冬育油透明”實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)一步完善，獲得更佳的觀察效果［3-5］。

雖然整體染色透明技術(shù)已經(jīng)非常成熟，非常便捷，然而這種方法也是有它的局限性的：第一，后期觀察時(shí)需要微分干涉顯微鏡，這樣一來(lái)就把大多數(shù)缺少相關(guān)設(shè)備的人員拒之門外。第二，雖然能夠進(jìn)行觀察、照相，然而樣品并不能進(jìn)行長(zhǎng)期保存，不利于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的后期積累。所以，仍然有很多人還在進(jìn)行石蠟切片的制作。眾所周知，石蠟制片非常煩瑣，這樣，優(yōu)化制片步驟便是當(dāng)務(wù)之急，本文結(jié)合整體染色透明技術(shù)，對(duì)亞麻子房石蠟切片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，并闡述操作過(guò)程中的關(guān)鍵技術(shù)。

1　取材與固定

新鮮采集的亞麻授粉后的子房直接放入FAA固定液中，固定48h后可長(zhǎng)時(shí)間保存。用50%酒精換洗2次，每次1～2h，繼續(xù)脫水至70%酒精，剝出子房，按取樣不同時(shí)期分別放入裝有70%酒精的50mL廣口試劑瓶，貼上標(biāo)簽。

剝出子房時(shí)，將材料倒入裝有70%酒精的培養(yǎng)皿中，用解剖刀和鑷子取下子房室。如需保存材料，可貯存于4℃冰箱中待用。

2　染色

用銨礬——蘇木精染色液染色。操作方法：倒出酒精，加入染色液，染色24h，之后倒出染色液，加入蒸餾水浸洗2次，每次30min。換入自來(lái)水2次，每次180min，使材料還藍(lán)，最后經(jīng)過(guò)蒸餾水換入30%酒精中。

3　脫水與透明

材料分別放入50%酒精、70%酒精、85%酒精、95%酒精各1h；之后100%酒精脫水三次，各0.5h；二甲苯與無(wú)水乙醇比例為1∶3、1∶1、3∶1各0.5h；二甲苯透明3次，各0.5h。更換脫水劑和透明劑時(shí)不用更換樣品瓶，只需用紗布包好瓶口，防止樣品掉出去就可，這樣就可以提高效率，增加樣品數(shù)量

4　透蠟與包埋

石蠟與二甲苯1∶1 (38℃過(guò)夜)→石蠟(58℃1h)3次。將樣品從石蠟中取出。

準(zhǔn)備足量85℃石蠟，準(zhǔn)備包埋盒，盒底墊浸水衛(wèi)生紙，一次性倒足石蠟，待包埋盒石蠟底部凝固，倒入材料，擺放好位置，確保材料周圍無(wú)氣泡。

5　切片與粘片

用單面刀片修整蠟塊，切片機(jī)夾子部分蠟塊比切片部位要厚，保證切片時(shí)蠟塊不斷裂，蠟塊平直、厚度適中、不破碎。使用轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)對(duì)蠟塊進(jìn)行切片，切片的厚度8～10um，切片角度15°。

貼片時(shí)直接用蒸餾水作為粘片劑，把切片浮于水浴鍋中進(jìn)行展片，等展片好了之后，用載玻片撈起切片，吸干多余的水，放于冰箱中保存，切片結(jié)束后把切片放在45℃恒溫箱中烘干3～4h。

6　脫蠟與制片

脫蠟，經(jīng)烘干后的切片放入裝有二甲苯的染色缸20min，之后經(jīng)過(guò)二甲苯(5min)、二甲苯(5min)、二甲苯與無(wú)水乙醇1∶1 (5min)、100%酒精(5min)、95%酒精(5min)、85%酒精(5min)、70%酒精(5min)、50%酒精(5min)、30%酒精(5min)、蒸餾水。晾干后，直接用中性樹膠封片。

綜上所述，傳統(tǒng)石蠟切片法首先對(duì)材料進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色、復(fù)水、封片，操作煩瑣，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，工作量大。整體染色透明切片法是先染后切，免去常規(guī)切片后一片片單獨(dú)染色和分色的繁重工作，可以節(jié)省時(shí)間、人力和藥品，增加樣品數(shù)量，減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，且切片不會(huì)脫落，染色清晰，特別適用于制作胚囊切片。而且這種方法觀察效果也不是整體染色透明法所能比的，觀察后材料保存也很方便。

參考文獻(xiàn)：

［1］Herr.J.M.,Jr.A new clearing- squash technique for the study of ovule development in angiosperms［J］..Amer,J.Bot.，1971，（58）：785- 790.

［2］楊弘遠(yuǎn).用整體染色與透明技術(shù)觀察胚囊、胚、胚乳和胚狀體［J］.植物學(xué)報(bào)，1986，28(6)：575- 581.

［3］劉向東.水稻多胚苗的初步研究Ⅰ·胚胎學(xué)的觀察［J］.福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1990，19(2)：131- 137.

［4］劉向東.水稻多胚苗的初步研究Ⅱ·來(lái)源與頻率［J］.福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1993，22(2)：1- 8，154.

［5］劉向東.高濃度激素噴穗對(duì)多胚水稻胚胎發(fā)育的形響［J］.中國(guó)水稻科學(xué)，1993，7(4)：239- 242.

Optimization of Linen Ovary Whole Stain-clearing and Slice Technique

CAO Hong-xun, SUN Yu-feng, SONG Xin-ling, LI Qiu-zhi, JIANG Zi-zhu
(Daqing Branch of Heilongjiang Academy of sciences, Daqing 163319, China)

Abstract:By using whole stain-clearing technique combined with paraffin section technology, this paper summarized the method of linen ovary paraffin section technology, which aimed at solving the shortcomings that the equipment for observing was lacked and samples could not be preserved long.Furthermore, it provided methodological support and reduced exploration time for the science researchers.

Key words:Paraffin section; Whole stain-clearing technique; Linen ovary

中圖分類號(hào)：S563.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-8646（2016）02-0009-02

收稿日期：2015- 12- 16

作者簡(jiǎn)介：曹洪勛（1982-），男，黑龍江拜泉人，在職研究生，農(nóng)藝師，從事亞麻遺傳育種研究。