鄧振山， 張偉民， 陳　苗

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 陜西 延安 716000)

?

蘋果樹主要病害內(nèi)生拮抗真菌的篩選及拮抗特性

鄧振山， 張偉民， 陳苗

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 陜西 延安 716000)

摘要：【目的】篩選蘋果樹腐爛病菌Valsa malimiyabe與蘋果樹炭疽病菌Glomeralla cingalata的內(nèi)生拮抗真菌，并研究其抑菌效果?！痉椒ā糠蛛x發(fā)病地區(qū)健康蘋果樹的根、莖及其根際土壤中的拮抗內(nèi)生真菌，室內(nèi)抑菌試驗(yàn)測定其對(duì)蘋果樹腐爛病菌和蘋果樹炭疽病菌的抑制作用; 發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)檢測其內(nèi)生真菌中抑菌物質(zhì)的耐熱性?！窘Y(jié)果】分離到的18株內(nèi)生真菌分屬3個(gè)屬，其中莖分離到的內(nèi)生真菌的種類和數(shù)量較多；對(duì)峙試驗(yàn)表明，對(duì)蘋果樹腐爛病菌和炭疽病菌的抑菌率高于60%的有8株，其中菌株J2、J16、J17對(duì)蘋果樹腐爛病的抑制率分別為82.75%、84.31%和82.35%，菌株T1對(duì)蘋果樹菌株炭疽病的抑制率為80.67%。拮抗真菌J2、J16、J17、J24、T1發(fā)酵液對(duì)2種病原菌分生孢子萌發(fā)的抑制率均不小于39.55%，最高達(dá)69.75%；在121 ℃時(shí)，J11和T1無菌濾液的熱穩(wěn)定性較好，而J2無菌濾液在100 °C時(shí)就失去了生物活性?！窘Y(jié)論】 拮抗真菌J2、J11、J16、J17、T1均對(duì)蘋果樹腐爛病菌及蘋果樹炭疽病菌有較強(qiáng)拮抗作用，可為開展這2種病害的生物防治研究提供潛在資源。

關(guān)鍵詞：蘋果樹； 蘋果樹腐爛病菌； 蘋果樹炭疽病菌； 內(nèi)生真菌； 抑菌活性； 耐熱性

蘋果樹MaluspumilaMill.屬薔薇科Rosaceae蘋果屬M(fèi)alus。蘋果樹腐爛病是蘋果生產(chǎn)上一種極為嚴(yán)重的病害，由黑腐皮殼屬Valsa(無性型為殼囊孢屬Cytospora)真菌引起的。該病發(fā)生區(qū)域廣、發(fā)病率高、防治困難，發(fā)病嚴(yán)重的果園樹體枝干殘缺，甚至造成大量死樹或毀園[1]；蘋果炭疽病又名苦腐病、晚腐病，是由子囊菌亞門小叢殼菌Glomerellacingulata所致，傳播速度快，已成為阻礙蘋果生產(chǎn)的主要病害[2- 4]。蘋果是我國陜北農(nóng)業(yè)的支柱，近年來遭受到多種病害的侵染，尤其是蘋果樹腐爛病與蘋果樹炭疽病[5]。

植物內(nèi)生真菌是指在植物寄主體內(nèi)度過全部或近乎全部生活周期而不使寄主表現(xiàn)任何癥狀的一類真菌。內(nèi)生真菌可能產(chǎn)生與宿主相同或相似的次生代謝產(chǎn)物，這些次生代謝產(chǎn)物是一些抗生素類和水解酶類等物質(zhì)，能影響病原菌的生長，最終導(dǎo)致其死亡[6]。許多內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物具有農(nóng)藥活性，利用植物內(nèi)生真菌來開發(fā)生物農(nóng)藥，是解決化學(xué)農(nóng)藥抗性、殘留和再猖獗問題的有效途徑之一[7]。王現(xiàn)坤等[8]的研究表明內(nèi)生真菌中鏈格孢屬拮抗菌群對(duì)蘋果樹腐爛病的拮抗作用較強(qiáng)；蔡光華等[9]研究表明蘋果樹腐爛病拮抗內(nèi)生細(xì)菌PG-10-8-11v菌株在高溫、紫外光的條件下具有較好的抑菌效果；鄧振山等[10]研究了銀杏GinkgobilobaL.葉片和莖內(nèi)生真菌對(duì)蘋果樹腐爛病菌的抑制作用；郭建新等[11]從銀杏根、莖、葉和果實(shí)中分離出的522株內(nèi)生真菌中有21.64%的菌株發(fā)酵液對(duì)蘋果樹炭疽病菌有較強(qiáng)的抑制作用；徐濤等[12]通過對(duì)健康蘋果樹樹皮內(nèi)生真菌的分離篩選出了對(duì)蘋果樹腐爛病菌生長有抑制作用的拮抗真菌，并且鑒定其主要為鏈格孢屬真菌。但鮮見利用內(nèi)生真菌同時(shí)來防治蘋果樹腐爛病和蘋果樹炭疽病的研究報(bào)道。本研究對(duì)發(fā)病地段的健康蘋果樹不同部位以及根際土壤中的內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離，并對(duì)篩選出的拮抗真菌進(jìn)行了液體培養(yǎng)，檢測了發(fā)酵濾液和菌絲體提取物對(duì)2種病原菌的抑菌活性以及抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性，旨在確定它們的抑菌特性，為進(jìn)一步研究其內(nèi)生拮抗真菌代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分及作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料

2013年從延安市寶塔區(qū)棗園蘋果種植園發(fā)病區(qū)的健康果樹上采集根、莖(采集的根和莖的木質(zhì)化程度要低且根系不要須根)以及蘋果樹的根際土壤，進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離。

蘋果樹腐爛病菌Valsamalimiyabe、蘋果樹炭疽病菌Glomerallacingulata病原菌由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室鑒定并保藏。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、瓊脂20 g·L-1，；改良的PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1、蘋果樹枝碾碎磨粉100 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、瓊脂20 g·L-1；30%ABA培養(yǎng)基[13]：蘋果樹枝碾碎磨粉300 g·L-1、瓊脂20 g·L-1、水1 L。

1.2方法

1.2.1內(nèi)生真菌的分離和純化內(nèi)生真菌采用組織塊培養(yǎng)[14]。在超凈工作臺(tái)上，將采集的蘋果樹根、莖，分別用清水洗凈表面附著的雜質(zhì)后進(jìn)行表面消毒(在φ為75%的乙醇溶液中浸泡 1 min，無菌水沖洗3次，再用w為0.1%的氯化汞溶液浸泡60～90 s，無菌水沖洗5次)，滅菌濾紙吸干多余水分后，用滅菌剪及滅菌刀將材料切割為6～8段(每段約0.3～0.5 mm)，將表面消毒的材料分別置于改良的PDA培養(yǎng)基、30%ABA培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基平板中，每培養(yǎng)皿3～5段，28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)5～6 d。根際土壤經(jīng)晾曬、研磨后用無菌水浸泡，28 ℃恒溫?fù)u床振蕩12 h，取懸濁液，采用系列稀釋法，在PDA培養(yǎng)基上涂布，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～6 d。定期觀察，采用菌絲尖端挑取法，根據(jù)菌絲顏色、形態(tài)以及長出的先后順序，挑取組織切口處長出的菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，反復(fù)純化直至獲得單一菌株，斜面保存并編號(hào)備用。經(jīng)表面消毒不做處理的材料在培養(yǎng)基上作組織印跡對(duì)照處理，檢驗(yàn)消毒效果。

1.2.2拮抗菌株的篩選依據(jù)文獻(xiàn)[15]，采用平板對(duì)峙法進(jìn)行。以蘋果樹腐爛病和蘋果樹炭疽病病原菌為靶標(biāo)，將病原菌接種于PDA平板進(jìn)行活化，28 ℃下培養(yǎng)至病原菌長滿平板，用滅過菌的4 mm打孔器分別對(duì)純化的內(nèi)生真菌和病原菌打孔，采用四點(diǎn)對(duì)峙法(在含有20 mL PDA的平板兩端相距3 cm處放置直徑為4 mm的生長旺盛的病原菌和內(nèi)生真菌菌餅)，每處理重復(fù)3次，以各4 mm病原菌餅圓盤為對(duì)照，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待對(duì)照組和試驗(yàn)組培養(yǎng) 4 d后, 采用十字交叉法測量對(duì)照組直徑(D對(duì)照)和處理組直徑(D處理)，計(jì)算抑制率。

1.2.3內(nèi)生真菌發(fā)酵液和菌絲提取物的拮抗活性測定無菌條件下，將保存的內(nèi)生真菌接種到PDA平板上，28 ℃培養(yǎng) 5 d 活化，將活化的內(nèi)生真菌再分別接種到500 mL PDA的三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng) 10 d后，5 000 r·min-1離心 5 min取上清液，并經(jīng)過 0.22 μm 的微孔濾膜真空抽濾，濾液收集、保存?zhèn)溆谩?/p>

菌絲提取物的制備及處理方法參照文獻(xiàn)[16]。菌絲體50 ℃條件下烘干，研磨成粉末后按照 1 g 菌絲體加 9 mLφ為95%的乙醇溶液的比例在45 ℃水浴條件下分3次提取，3次提取時(shí)間分別為24、4和2 h，最后水浴除去溶劑，烘干并保存提取物備用。

拮抗活性測定采用生長速率法[17]。取內(nèi)生真菌發(fā)酵液 10 mL，加90 mL滅菌的PDA培養(yǎng)基混勻后倒平板，對(duì)照組加等量的無菌水。用直徑4 mm的打孔器在培養(yǎng) 5 d的供試病原真菌的菌落邊緣打取菌餅，再將菌餅菌絲面朝下接種到含發(fā)酵液的培養(yǎng)基平板正中央。取菌絲提取物用無菌水配制0.1 g·mL-1的溶液，取 10 mL該溶液加入 90 mL滅菌的PDA培養(yǎng)基混勻后倒平板，對(duì)照組同樣加等量的無菌水。含菌絲提取物的PDA培養(yǎng)基平板接種方法同上。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，采用十字交叉法測量對(duì)照組和處理組直徑，計(jì)算抑制率。

1.2.4內(nèi)生真菌發(fā)酵液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的影響將病原真菌接種至改良的PDA培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)4 d后，轉(zhuǎn)接到30% ABA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d，待菌落表面產(chǎn)生大量突起的分生孢子器和分生孢子絲后，在超凈工作臺(tái)上，用滅菌的打孔器打取4 mm菌餅，挑取到無菌的試管中，加入無菌水，振蕩攪動(dòng)使培養(yǎng)基的孢子盡可能多地存在于水中，取1滴于顯微鏡下觀察，根據(jù)文獻(xiàn)[18]的標(biāo)準(zhǔn)，在低倍鏡(10×10)下的視野內(nèi)孢子數(shù)達(dá)到50~90個(gè)。

在無菌條件下，用移液槍吸取孢子懸液300 μL于1.5 mL的小離心管中，加入同等體積的內(nèi)生真菌發(fā)酵液，再加入200 μL的PDA液體培養(yǎng)基，振蕩混勻后，對(duì)照加同等體積的無菌水，28 ℃恒溫水浴12 h后，鏡檢孢子萌發(fā)情況，并計(jì)算孢子萌發(fā)率和孢子萌發(fā)的抑制率。

孢子萌發(fā)率=(萌發(fā)孢子數(shù)/孢子調(diào)查數(shù))×100%，

孢子萌發(fā)的抑制率=(對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率)/對(duì)照孢子萌發(fā)率×100%。

1.2.5發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性J2、J11、J16、J17、T1發(fā)酵液經(jīng)過無菌濾紙和0.22 μm微孔濾膜過濾，在無菌條件下取15 mL于滅菌試管中，經(jīng)過20(CK)、40、60、80、100 ℃水浴加熱和121 ℃高溫滅菌處理30 min[19]，冷卻到室溫，在超凈工作臺(tái)中，取處理過的發(fā)酵液加入100 mL的已滅菌并且溫度降至50 ℃以下的PDA培養(yǎng)基中，充分混勻后，在滅菌平板中倒入約15 mL，待培養(yǎng)基凝固后，采用平板打孔法，在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基中央接入4 mm的蘋果樹腐爛病菌餅、蘋果樹炭疽病菌餅，以28 ℃發(fā)酵液作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，用十字交叉法測量蘋果樹腐爛病菌和蘋果樹炭疽病菌的直徑，計(jì)算抑制率。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生真菌的分離和純化

從病區(qū)健康蘋果樹的根、莖及其根際土分離得到真菌共有18株。通過形態(tài)學(xué)對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行初步鑒定，分離得到的內(nèi)生真菌分屬3個(gè)屬，包括鏈格孢屬Alternariasp.、 莖點(diǎn)霉屬Phomasp.和球殼孢屬Sphaeropsissp.。不同部位真菌的種類和數(shù)量也存在差別，其中莖部分離的菌株數(shù)最多，為9株，其次是根部5株，根際土4株。其中鏈格孢屬為蘋果樹莖和根部占絕對(duì)優(yōu)勢的內(nèi)生真菌菌株，占總分離頻率的50.0%(表1)。

表1　不同部位的真菌分離結(jié)果

2.2內(nèi)生真菌對(duì)蘋果樹病原菌的拮抗作用

對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，共有8株真菌對(duì)蘋果樹腐爛病菌和蘋果樹炭疽病菌的生長有抑制作用，占供試菌株總數(shù)的44%。其中有5株真菌對(duì)蘋果樹腐爛病菌和炭疽病菌的生長均有抑制作用，另有3株真菌對(duì)蘋果樹腐爛病菌或炭疽病菌的生長分別有不同的抑制作用，不同真菌菌株對(duì)蘋果樹腐爛病菌菌絲生長的抑制率有一定差異，其中抑制率在 80% 以上的有J2、J16、J17，對(duì)蘋果樹腐爛病菌的生長抑制率分別達(dá)82.75%、84.31%、82.35%。除J11和T4無抑制作用外，剩余的菌株對(duì)蘋果樹腐爛病菌生長的抑制率集中于60%~70%；T1內(nèi)生真菌對(duì)蘋果樹炭疽病菌的抑制率最高，達(dá)80.67%，除T3菌株無抑制作用外，其他6株內(nèi)生真菌對(duì)蘋果樹炭疽病菌的抑制率均大于70%。

表2蘋果拮抗真菌對(duì)蘋果樹腐爛病菌菌絲生長的抑制作用1)

Tab.2Inhibiory effects of antagonistic fungi on mycelial growth of Valsa ceratosperma and Glomeralla cingulata in apple tree

菌株抑制率/%蘋果樹腐爛病菌蘋果樹炭疽病菌J282.75±0.15a79.27±0.09abJ11—77.78±0.15abJ1684.31±0.12a72.59±0.15abJ1782.35±0.09a71.11±0.12bJ2470.12±0.07b70.37±0.12bT167.06±0.03bc80.67±0.12aT361.65±0.12c—T4—74.07±0.09ab

1)“—”表示無抑制作用; 同列數(shù)據(jù)后凡具有一個(gè)相同字母者，表示差異不顯著(P>0.05, Duncan’s法)。

如圖1a所示，在抑菌帶的邊緣，蘋果樹腐爛病菌的菌絲體分布不均、明顯變薄、顏色變成褐色，菌絲的生長受到明顯的抑制，其對(duì)照組(圖1c)蘋果樹腐爛病菌在接種第4 天后迅速長滿整個(gè)平板，J16(圖1a)和T1(圖1b)分別對(duì)蘋果樹腐爛病菌和蘋果樹炭疽病菌的生長抑制較為明顯，抑菌帶周圍的菌絲體分布不均、顏色變成褐色。

2.3發(fā)酵濾液及菌絲體提取物抑菌效果

由表3可知，不同拮抗真菌發(fā)酵后的濾液對(duì)蘋果樹腐爛病菌和炭疽病菌菌絲生長的抑制作用差別較大，對(duì)蘋果樹腐爛病菌的抑制率最大為77.14%，對(duì)蘋果樹炭疽病菌的抑制率最大為76.22%，其他菌株的抑制率都大于60%。菌絲提取物對(duì)病原菌菌絲的生長抑制作用不顯著，其中對(duì)病原菌生長有較強(qiáng)抑制作用的拮抗真菌J16和T1，最大抑制率均小于9%。

a：接種內(nèi)生真菌J16和蘋果樹腐爛病菌; b：接種內(nèi)生真菌T1和蘋果樹炭疽病菌; c:蘋果樹腐爛病菌; d: 蘋果樹炭疽病菌。

Tab.3Inhibition rates of sterile fermentation filtrates and extracts from endophytic fungal mycelium on mycelial growth of pathogen

菌株發(fā)酵濾液抑制率/%菌絲體提取物抑制率/%蘋果樹腐爛病菌蘋果樹炭疽病菌蘋果樹腐爛病菌蘋果樹炭疽病菌J267.71±0.09a64.07±0.12b5.71±0.15a5.11±0.12aJ11—65.56±0.10b—5.11±0.12aJ1677.14±0.15a8.57±0.12aJ1764.86±0.12a4.86±0.18aT176.22±0.09a8.22±0.09a

1)“—”表示沒有抑制作用，空白表示未測;同列數(shù)據(jù)后凡具有一個(gè)相同字母者,表示差異不顯著(P>0.05，Duncan’s法)。

2.4發(fā)酵液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用

內(nèi)生真菌發(fā)酵液對(duì)蘋果樹腐爛病和蘋果樹炭疽病分生孢子萌發(fā)有抑制作用，且不同菌株的發(fā)酵液對(duì)分生孢子萌發(fā)的抑制作用有較大差異。從表4中可以看出，除J11和T4外，所測的菌株對(duì)蘋果樹腐爛病菌孢子萌發(fā)的抑制率均大于45%，其中對(duì)蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)抑制作用最強(qiáng)的為J16，抑制率為69.75%；除T3外，其他菌株對(duì)蘋果樹炭疽病菌分生孢子萌發(fā)抑制率均不小于39.55%，其中作用最強(qiáng)的為T1，抑制率為69.43%，但內(nèi)生真菌的發(fā)酵液對(duì)2種病原菌孢子萌發(fā)抑制率均小于70%，分析可能是發(fā)酵液中的活性物質(zhì)濃度不足。

表4內(nèi)生真菌發(fā)酵液對(duì)蘋果樹腐爛病菌和炭疽病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用1)

Tab.4Inhibitory effect of zymotic fluid of antagonistic fungi on conidial germination of Valsa ceratosperma and Glomeralla cingulata in apple tree

菌株蘋果樹腐爛病菌蘋果樹炭疽病菌萌發(fā)率/%抑制率/%萌發(fā)率/%抑制率/%J236.42±2.52ab63.36±2.03d53.11±5.03bc46.80±5.03abJ11——54.92±5.49bc45.08±5.49abJ1630.46±1.53a69.75±1.20e41.26±4.33d57.17±4.33cdJ1739.74±3.21bc60.48±3.71cd52.07±4.06de50.95±2.31bcJ2443.71±2.52cd56.07±2.85bc63.99±4.41f39.55±4.41aT149.67±3.06de50.55±2.85ab31.61±8.14a69.43±6.94eT352.98±4.16e47.24±4.48a——T4——39.64±8.09fg60.27±6.94d

1)“—”表示沒有抑制作用;同列數(shù)據(jù)后凡具有一個(gè)相同字母者,表示差異不顯著(P>0.05，Duncan’s法)。

2.5發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性

由表5 可知，J2發(fā)酵液作用的菌落直徑隨溫度升高而變大，且60~121℃與對(duì)照相比差異顯著，在溫度超過100 ℃時(shí)，抑制率為0，表明此抑制物質(zhì)可能因高溫失去生物活性。除121℃外，J16發(fā)酵液作用的菌落直徑相對(duì)于對(duì)照組并未隨溫度升高存在顯著差異，說明其抑制物質(zhì)對(duì)熱具有較好的穩(wěn)定性。J17隨溫度的升高抑菌效果不斷提高，但與對(duì)照相比均無顯著差異，到121 °C時(shí)抑制率為17.2%，說明溫度對(duì)其無菌濾液的影響較小。

表5　蘋果樹腐爛病菌拮抗真菌J2,J16和J17發(fā)酵濾液的熱穩(wěn)定性

1)同列數(shù)據(jù)后凡具有一個(gè)相同字母者,表示差異不顯著(P>0.05，Duncan’s法)。

由表6可知，與對(duì)照相比，菌株J2發(fā)酵液作用的病原菌直徑隨溫度的升高而顯著增加，且最大直徑達(dá)到8.10 cm，與對(duì)照組相比，其抑制率隨溫度升高而降低，且在100 ℃和121 ℃時(shí)，抑制率為0，這可能是由于發(fā)酵濾液中含有的抑菌蛋白物質(zhì)因高溫作用生物活性降低所致；而J11和T1發(fā)酵液對(duì)溫度的穩(wěn)定性較好，可能是發(fā)酵液中含有非蛋白物質(zhì)，且此物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。

表6　蘋果樹炭疽病菌拮抗真菌J2,J11和T1發(fā)酵濾液的熱穩(wěn)定性1)

1)同列數(shù)據(jù)后凡具有一個(gè)相同字母者,表示差異不顯著(P>0.05，Duncan’s法)。

3討論與結(jié)論

本研究從蘋果樹發(fā)病地段健康植株的根、莖以及蘋果樹的根際土壤中篩選出具有抑制蘋果樹腐爛病菌和蘋果樹炭疽病菌的18株內(nèi)生拮抗真菌，并分別歸于3個(gè)屬，其中鏈格孢屬內(nèi)生真菌是優(yōu)勢菌株，占總分離菌株的50.0%。這與徐濤等[12]的研究結(jié)果一致，該研究從蘋果樹不同部位枝干的樹皮中分離得到抑制蘋果樹腐爛病菌13個(gè)屬的內(nèi)生真菌，其中鏈格孢屬內(nèi)生真菌是優(yōu)勢菌株，占總分離菌株的73.27%。球殼孢屬是本研究新報(bào)道的內(nèi)生真菌屬，其他屬真菌已有相關(guān)報(bào)道[12]。對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明，分離到的8株內(nèi)生真菌中，有5株分別對(duì)蘋果樹腐爛病和蘋果樹炭疽病的抑菌率超過67.00%，其中T1對(duì)蘋果樹炭疽病的抑制率達(dá)到80.67%。發(fā)酵濾液都至少對(duì)2種病原菌有大于60%的抑菌活性，并且其中J2、J16、J17的發(fā)酵濾液對(duì)蘋果樹腐爛病的抑制率分別為82.75%、84.31%、82.35%。

展麗然[20]研究了土壤中放線菌對(duì)蘋果樹腐爛病菌的抑制作用，并優(yōu)化了拮抗放線菌的發(fā)酵條件。王東昌等[21]從蘋果樹上分離到了拮抗菌株AT9706，在室內(nèi)測定其對(duì)蘋果樹腐爛病菌的抑制效果達(dá)到了100%，田間采用AT9706制劑的防治效果達(dá)到了95%。Xin等[22]從毛百楊Populustomentosa上分離到1株對(duì)蘋果樹腐爛病菌有較好拮抗作用的內(nèi)生螺旋毛殼Chaetomiumspirale菌株ND35，溫室接種試驗(yàn)表明，用ND35處理的蘋果樹腐爛病的發(fā)生率明顯的比用其他方法處理的果樹低。以上研究僅是針對(duì)一種病原真菌篩選拮抗內(nèi)生菌，并且多數(shù)為其他種植物的內(nèi)生菌。郭曉等[23]研究表明，螺旋毛殼菌ND35分泌的胞外酶β-1,3-葡聚糖酶對(duì)蘋果樹炭疽病菌、楊樹腐爛病菌Valsasordida以及蘋果樹腐爛病菌的菌絲生長和孢子的萌發(fā)有明顯的抑制作用。本試驗(yàn)通過對(duì)發(fā)病地段的健康蘋果樹不同部位進(jìn)行篩選后得到同時(shí)抑制蘋果樹腐爛病菌和蘋果樹炭疽病菌的拮抗內(nèi)生真菌，并且抑制作用較為顯著。進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)檢測了其內(nèi)生真菌中抑菌物質(zhì)的耐熱特性，結(jié)果表明拮抗真菌J2、J16、J17、J24和T1發(fā)酵液對(duì)2種病原菌分生孢子萌發(fā)抑制率均不小于39.55%，最高可達(dá)69.75%，J11和T1無菌濾液的熱穩(wěn)定性較好，說明此無菌濾液中也可能存在類似的抑菌蛋白或其他大分子物質(zhì)，且對(duì)熱有較好的穩(wěn)定性，能引起系統(tǒng)免疫，而J2的無菌濾液在100 ℃時(shí)失去了生物活性，可能是抑菌蛋白因高溫失去了生物活性或其他大分子物質(zhì)的熱穩(wěn)定性較差。但是未涉及到對(duì)抑菌物質(zhì)的提取和鑒定，對(duì)于菌株的鑒定和田間防治效果還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉如香. 蘋果樹腐爛病菌分生孢子的萌發(fā)、存活和侵染條件的研究[D]. 保定: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

[2]李培夫. 蘋果腐爛病防治新技術(shù)[J]. 農(nóng)村科技, 2005(4): 17.

[3]楊萬寶. 蘋果炭疽病發(fā)生原因及防治措施[J]. 現(xiàn)代農(nóng)村科技, 2011(19): 26.

[4]王敬尊. 蘋果炭疽病的識(shí)別與防治[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 37(18): 8560-8561.

[5]鄧振山, 白重炎, 李軍, 等. 陜北蘋果常見真菌病害病原菌的分離鑒定研究[J]. 延安大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2006, 25 (4):65-70.

[6]李培，王永斌. 植物內(nèi)生真菌的研究與展望[J]. 飲料工業(yè), 2008, 11(7): 11-13.

[7]AZEVEDP J L, MACCHERONI J R W, PEREIRA J O, et al. Endophytic microorganisms: A review on tropical plants[J]. Electron J Biotechn, 2000, 3(1): 40-65.

[8]王現(xiàn)坤, 張曉華, 赫雙紅. 側(cè)柏內(nèi)生真菌的分離鑒定及抗菌活性篩選[J]. 農(nóng)藥, 2010, 49(7): 519-521.

[9]蔡光華, 戰(zhàn)峰, 王曉玲. 蘋果樹腐爛病拮抗內(nèi)生細(xì)菌PG-10-8-11v 菌株抗菌物質(zhì)的初步研究[J]. 西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2011, 37(6): 945-949.

[10]鄧振山, 趙龍飛, 張薇薇, 等. 銀杏內(nèi)生真菌的分離及其對(duì)蘋果腐爛病病原菌的拮抗作用[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2009, 29(3): 608-613.

[11]郭建新, 孫廣宇, 張榮, 等. 銀杏內(nèi)生真菌抗真菌活性菌株的分離和篩選[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2005, 14(4): 14-17.

[12]徐濤, 胡同樂, 王亞南, 等. 蘋果樹皮內(nèi)生真菌的分離及其對(duì)腐爛病的生物防治潛力[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2012, 39 (4): 327-333.

[13]周宗山, 徐成楠, 吳玉星, 等. 蘋果樹腐爛病病菌分生孢子獲取方法研究[J].中國果樹, 2011(2): 41- 43.

[14]楊潤亞, 李艷華, 柳娜娜. 連翹內(nèi)生真菌的分離及其抑菌活性初步研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35 (15)： 4561- 4563.

[15]夏偉, 張紅, 顏艷偉, 等. 棘孢木霉L4對(duì)立枯絲核菌的拮抗機(jī)制[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2010, 37 (5): 477- 478.

[16]孫杰, 楊潤亞, 任曉明. 三種海藻內(nèi)生真菌的分離及其抑菌活性研究[J].食品科學(xué), 2007(11): 357-359.

[17]王艷紅, 吳曉民, 朱艷萍, 等. 溫郁金內(nèi)生真菌ChaetomiumglobosumL18對(duì)植物病原菌的抑菌譜及拮抗機(jī)理[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2012, 32(7): 2040-2046.

[18]蔣繼宏, 李曉儲(chǔ), 陳鳳美, 等. 植物抽提物對(duì)蘋果炭疽病菌分生孢子的抑制作用[J]. 江蘇林業(yè)科技, 2004, 31 (4): 23-25.

[19]鄧振山, 候改成, 孫志宏, 等. 番茄灰霉病菌拮抗菌D6和D10發(fā)酵條件的優(yōu)化及其抑菌效果[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2013, 41 (9): 73-77.

[20]展麗然. 蘋果腐爛病菌拮抗放線菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件的優(yōu)化[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[21]王東昌, 辛玉成, 郝秀青, 等. 蘋果樹枝干病害的生物防治[J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué), 2001, 26 (2): 49-50.

[22]XIN Y F, SHANG J J. Bio-control trials ofChaetominumspiraleND35 against apple canker[J]. J Forest Res-Jpn, 2005, 16 (2): 121-124.

[23]郭曉, 高克祥, 印敬明, 等. 螺旋毛殼 ND35β-1, 3-葡聚糖酶的誘導(dǎo)、性質(zhì)及其抑菌作用[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2005, 35(6): 493-503.

【責(zé)任編輯霍歡】

Screening fungal endophytes from apple trees and their antagonistic characteristics

DENG Zhenshan, ZHANG Weimin, CHEN Miao

(College of Life Sciences, Yan’an University, Yan’an 716000, China)

Abstract：【Objective】 To screen fungal endophytes against Valsa malimiyabe and Glomeralla cingulata from apple trees and explore their inhibitory effects.【Method】Fungal endophytes were isolated from roots, stems and rhizosphere soil of healthy apple plants. Their antifungal activities against V. malimiyabe and G. cingulata were examined using in vitro dual culture assay. Heat-resistant properties of antifungal substances were tested using the fermentation culture of the isolated fungal endophytes.【Result】Eighteen endophytic fungus strains belonging to three genera were isolated and half of the 18 strains were from stem. The dual culture assay showed eight strains had above 60% inhibition rate against V. malimiyabe and G. cingulata. J2, J16and J17strains strongly inhibited V. malimiyabe with the inhibition rates of 82.75%, 84.31% and 82.35% respectively. The inhibition rate of T1to G. cingulata reached 80.67%. The culture filtrates of fungal endophytes J2，J16，J17，J24，T1inhibited the conidia germination of both pathogens, and all of the inhibition rates were not less than 39.55% and the highest value was 69.75%. The sterile filtrate of J11and T1showed high heat stability at 121 ℃, while J2lost bioactivity at 100 ℃. 【Conclusion】 Fungal endophytes J2, J11, J16, J17and T1have strong inhibitory effects against V. malimiyabe and G. cingulata, and therefore are potential candidates for biological control of these two pathogens.

Key words：apple tree; Valsa malimiyabe; Glomeralla cingulata; fungal endophyte; antifungal activity; heat resistance

中圖分類號(hào)：S432.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001- 411X(2016)02- 0073- 06

基金項(xiàng)目：陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)計(jì)劃(2013JM3004); 陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程(2012CGX7， 2012KTZB03-02-03)

作者簡介：鄧振山(1969—)，男，副教授，博士，E-mail: zhenshandeng214@163.com

收稿日期：2015- 04- 28優(yōu)先出版時(shí)間：2016- 01- 18

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20160118.1651.018.html

鄧振山， 張偉民， 陳苗.蘋果樹主要病害內(nèi)生拮抗真菌的篩選及拮抗特性[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,37(2):73- 78.