王 健，楊 青，孟慶杰

(聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東聊城 252059)

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激光掃描共聚焦顯微鏡在園藝植物研究中的應(yīng)用

王 健，楊 青，孟慶杰*

(聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東聊城 252059)

摘要綜述了激光共聚焦顯微鏡的原理以及激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)在園藝植物細(xì)胞學(xué)、植物熒光方面、發(fā)育生物學(xué)和遺傳學(xué)的應(yīng)用研究進(jìn)展，并對其在園藝植物研究中的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞激光掃描共聚焦顯微鏡；園藝植物；熒光；花粉粒

Application of Laser Scanning Confocal Microscope in Horticultural Plants

WANG Jian, YANG Qing, MENG Qing-jie*(College of Life Science and Technology, Liaocheng University, Liaocheng, Shandong 252059)

AbstractThe principle of laser scanning confocal microscope and the research progress on application in horticultural plant pollen morphology, pollen cytoskeleton, cytology, genetics, developmental biology, and plant fluorescence were reviewed, the application prospect in researches of horticultural plants was forecasted.

Key wordsLaser scanning confocal microscope; Horticultural plants; Fluorescence; Pollen grains

激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的一種無損深層形態(tài)結(jié)構(gòu)分析的新技術(shù),在醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、生物科學(xué)、植物學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。它是集顯微技術(shù)、高速激光掃描、電子攝像及計算機(jī)圖像處理技術(shù)為一體的現(xiàn)代高科技手段。該技術(shù)雖然已經(jīng)深入生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域，但在園藝植物方面的研究中應(yīng)用較少。鑒于此，筆者綜述了LSCM的原理以及激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)在園藝植物細(xì)胞學(xué)、植物熒光方面、發(fā)育生物學(xué)和遺傳學(xué)的應(yīng)用研究進(jìn)展，以期為該技術(shù)在園藝植物上的推廣應(yīng)用提供參考。

1LSCM的原理

LSCM是在不損害原有結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的一種深層形態(tài)結(jié)構(gòu)分析的新技術(shù)。由于不同的樣品對激光發(fā)射器的要求不同，常用的激光器有ArUV(351、364 nm)、AR(457、488、514 nm)、HeNe(543、633 nm)等。

LSCM的基本原理是運(yùn)用紫外光或可見光的激光掃描束通過光源針孔形成的點光源，對自己能發(fā)出熒光的標(biāo)本或經(jīng)熒光染料標(biāo)記后能發(fā)出熒光的標(biāo)本的焦平面上進(jìn)行逐點掃描，激發(fā)其產(chǎn)生熒光。采集點的光信號通過探測針孔到達(dá)光電倍增管，經(jīng)光電倍增管檢測出發(fā)射光的波長及強(qiáng)度，然后經(jīng)過計算機(jī)的轉(zhuǎn)換，最終在顯示屏上形成樣品的二維和三維圖像。由于入射光源針孔及檢測針孔與物鏡焦平面的位置是共軛的關(guān)系，所以進(jìn)行點掃描時，焦平面上的點會同時聚焦于光源針孔和檢測針孔上，以便抑制在同一焦點平面上非測點的散雜熒光以及來自樣品中的非焦平面的熒光，從而達(dá)到只有掃描點成像而其他的干擾點不會成像的目的，最終經(jīng)過逐點掃描形成整個標(biāo)本的光學(xué)切片。目前，激光掃描共聚焦顯微鏡具有高反差、高靈敏度、高分辨率等優(yōu)點，可對樣品進(jìn)行無損傷、逐層的掃描[1-4]。

2LSCM在園藝植物細(xì)胞學(xué)研究中的應(yīng)用

2.1LSCM在花粉粒形態(tài)結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用何川生等[5]利用LSCM技術(shù)對37種煙草花粉進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)不同的煙草花粉的形態(tài)結(jié)構(gòu)有差異，而同一品種煙草花粉形態(tài)結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，為煙草分類及其進(jìn)化研究提供重要依據(jù)。李林光等[6]利用LSCM技術(shù)對四倍體品種天星蘋果及二倍體富士蘋果的花粉萌發(fā)力、花粉形態(tài)及胚囊發(fā)育特征進(jìn)行觀察研究，尋找到天星蘋果在結(jié)果方面不及富士蘋果的原因，以便更好地改進(jìn)，培育出優(yōu)良品種。李國平等[7]為了研究不能自發(fā)熒光的黑松花粉管，對其進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后利用LSCM技術(shù)研究了其形態(tài)結(jié)構(gòu)并觀察了不同濃度的蔗糖對花粉管生長的影響，進(jìn)而對比了其與被子植物的不同。丁亮等[8]應(yīng)用LSCM技術(shù)對紅花粉粒進(jìn)行掃描，利用Laser-Sharp圖像處理軟件重建其三維結(jié)構(gòu)，并敘述了LSCM的成像原理、特點以及在植物孢粉學(xué)研究中的應(yīng)用前景。

2.2LSCM在花粉細(xì)胞骨架研究中的應(yīng)用李國平等[9]用4種不同的染色劑和染色方法對雪松花粉和花粉管進(jìn)行染色，在特定的激發(fā)光源下，通過試驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)曙紅-Hoechst 33342雙染的雪松樣品細(xì)胞核結(jié)構(gòu)最清晰，建立了一種簡便易行、有效的制片程序，并用LSCM技術(shù)較好地展現(xiàn)了雪松花粉和花粉管的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞核狀態(tài)、行為。

李巖等[10]應(yīng)用免疫熒光和熒光標(biāo)記方法，結(jié)合LSCM技術(shù)，觀察百合花粉以及花粉管內(nèi)微絲和微管的分布，結(jié)果表明化學(xué)固定方法較好地保存花粉和花粉管內(nèi)微絲；用免疫熒光法標(biāo)記發(fā)現(xiàn)微管大多分布在距離花粉管頂部10～20 μm的范圍內(nèi)；在花粉管中，存在共分布現(xiàn)象的微絲骨架與微管骨架并不多，只有少數(shù)微絲與微管是相互平行排列的。

李國平等[11]利用LSCM技術(shù)和免疫熒光標(biāo)記法對黑松的花粉和花粉管中微管的骨架進(jìn)行研究，通過在含秋水仙堿的培養(yǎng)基中萌發(fā)的黑松與正常萌發(fā)的黑松花粉管的結(jié)構(gòu)對比，發(fā)現(xiàn)了含秋水仙堿的培養(yǎng)基中萌發(fā)的黑松花粉管頂端腫脹產(chǎn)生的原因。研究表明，與被子植物相比，裸子植物花粉管頂端的微管網(wǎng)絡(luò)對花粉管頂端的形態(tài)及生長方向非常重要。

徐霞等[12]以川百合花粉原生質(zhì)體為材料，以微量DMSO為滲透劑、Alex-phalloidin為探針的熒光標(biāo)記，并結(jié)合LSCM技術(shù)，研究了蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化作用參與花粉原生質(zhì)體在極性形成、花粉管萌發(fā)及花粉管生長過程中微絲骨架的列陣變化。

2.3LSCM在細(xì)胞內(nèi)、外Ca2+變化及其作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的研究尚忠林等[13]以川百合花粉為材料，利用孵育法在花粉原生質(zhì)體中，特別是利用低溫裝載法在完整花粉粒中成功地載入酯化形式的Ca2+熒光探針Fluo-3AM，并利用LSCM技術(shù)對花粉細(xì)胞質(zhì)中游離Ca2+的分布特點進(jìn)行研究。

魯振華等[14]采用LSCM技術(shù)，以Fluo-3AM-ester為熒光探針研究桃果肉和葉柄組織中Ca2+的分布，結(jié)果表明Fluo-3AM-ester可作為熒光探針對桃不同組織中游離的Ca2+信號強(qiáng)度和分布特征進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究Ca2+對果實品質(zhì)的影響、合理噴施鈣元素提供了理論依據(jù)。

郭光明等[15]利用LSCM技術(shù)觀察低溫裝載有Ca2+熒光探針Fluo-3的百合花粉細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+與培養(yǎng)基中硼酸的關(guān)系。結(jié)果表明，硼能促進(jìn)細(xì)胞外的Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，維持百合花粉細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+較高的濃度。

3LSCM在園藝植物熒光方面的應(yīng)用

周建濤等[16]采用LSCM技術(shù)研究了外源鈣調(diào)素(CaM)及其抗血清對“豐水”梨白花(不親和)和異花(親和)授粉后花柱自發(fā)熒光變化的影響。結(jié)果表明，外源CaM及其抗血清對白花、異花授粉的生理代謝過程均有影響，為研究鈣調(diào)素在植物自交不親和性反應(yīng)中的作用提供了理論依據(jù)。

何川生等[17]利用LSCM技術(shù)對不同類型煙草材料的花粉自發(fā)熒光強(qiáng)度進(jìn)行了定量檢測，發(fā)現(xiàn)不同類型及品種之間花粉自發(fā)熒光強(qiáng)度存在明顯差異，可作為煙草品種鑒別的重要依據(jù)。

畢玉花等[18]以非洲菊為研究對象，對其生長發(fā)育過程(P1~P6期)中外輪舌狀花進(jìn)行延遲熒光(DF)分析，并利用LSCM成像系統(tǒng)對其各期表皮細(xì)胞中葉綠素的分布和相對含量進(jìn)行檢測，以研究非洲菊外輪舌狀花發(fā)育過程中延遲熒光改變與其葉綠素變化的關(guān)系。

項海波等[19]根據(jù)蔬菜葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度將隨污染的程度發(fā)生改變的原理，采用LSCM技術(shù)分析蔬菜受重金屬污染后葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度的變化，建立了基于LSCM技術(shù)的蔬菜重金屬污染評價方法，進(jìn)一步為進(jìn)出口蔬菜的監(jiān)管奠定了方法學(xué)和技術(shù)理論基礎(chǔ)。

茶樹熒光性綠斑病是一種普遍發(fā)生的成葉生理性病害。蔣淑媛等[20]將pH熒光探針BCECF/AM導(dǎo)入茶樹熒光性綠斑病病葉、正常葉片切片，利用LSCM技術(shù)測定胞內(nèi)pH，結(jié)果表明病害葉片胞內(nèi)的pH與病害程度呈顯著正相關(guān)。測定病變?nèi)~片胞內(nèi)pH有利于探明病變細(xì)胞的生理變化，對闡明其發(fā)光機(jī)理以及發(fā)病機(jī)理有重要理論意義。

4LSCM在園藝植物發(fā)育學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域中的應(yīng)用

徐川梅等[21]利用LSCM技術(shù)，對孝順竹雄配子體發(fā)育過程進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)大部分孝順竹單倍體小孢子經(jīng)過2次有絲分裂過程最終形成成熟的三細(xì)胞花粉粒，但約有38%的孢子不能發(fā)育成正常的花粉粒，認(rèn)為這可能是孝順竹結(jié)實率低下的原因。

朱東姿等[22]利用LSCM技術(shù)對甜櫻桃品種“美早”和“布魯克斯”的雌配子體發(fā)育過程進(jìn)行了觀察。將甜櫻桃胚囊用戊二醛固定，脫水透明后直接采用LSCM進(jìn)行觀察，利用該法觀察到的雌配子體發(fā)育過程與用石蠟切片法觀察的一致，但是LSCM法更簡便、省時、準(zhǔn)確。

王穎等[23]利用LSCM技術(shù)對平邑甜茶與扎矮山定子雜交獲得6個皺葉矮生型株系的胚胎發(fā)育過程及發(fā)育特性進(jìn)行了觀察與研究。結(jié)果表明，皺葉矮生型株系的胚胎發(fā)育特征是以有性生殖為主的生殖方式，與親本扎矮山定子的胚胎發(fā)育特征較一致；與親本平邑甜茶不同，未出現(xiàn)平邑甜茶胚胎發(fā)育中的復(fù)雜現(xiàn)象，并表現(xiàn)出較弱的無融合生殖能力。

5LSCM在園藝植物遺傳學(xué)上的應(yīng)用

LSCM技術(shù)廣泛應(yīng)用于核酸分子雜交方面，與傳統(tǒng)的原位雜交技術(shù)相比，原位雜交的共聚焦技術(shù)具有操作簡單、快速、結(jié)果更清晰準(zhǔn)確的優(yōu)點，而采用LSCM對樣品進(jìn)行雙色標(biāo)記和探測，尤其對小染色體原位雜交的定位特別有用，也可在基因的表達(dá)和檢測方面借助LSCM技術(shù)。李國平等[24]應(yīng)用LSCM技術(shù)研究油杉小孢子的發(fā)生過程，油杉樣品經(jīng)曙紅-Hoechst 33342雙染和冬青油透明后，分別用488 nm紫外光進(jìn)行掃描，結(jié)果表明，在LSCM下可較好地再現(xiàn)油杉小孢子發(fā)生過程，清晰地顯示出油杉花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中核相的變化。

閻隆飛等[25]將運(yùn)用反義基因技術(shù)構(gòu)建成的植物不育基因?qū)胄←満头阎?，獲得大量轉(zhuǎn)基因小麥和番茄植株，檢測分析表明導(dǎo)入的反義肌動蛋白在雄蕊，特別是在花藥和花粉中表達(dá)正確，使花藥和花粉中內(nèi)源肌動蛋白基因的表達(dá)得到特異性的封閉或抑制，從而導(dǎo)致花藥和花粉細(xì)胞畸形或無活力，產(chǎn)生雄性不育。經(jīng)LSCM觀察轉(zhuǎn)基因植株的花粉發(fā)現(xiàn)花粉粒中的微絲明顯減少，而雌蕊并不受影響。

羅果等[26]為觀察外源hIL-12基因在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯不同組織部位的表達(dá)情況，采集轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的莖和塊莖組織進(jìn)行研究，以野生馬鈴薯為陰性對照，用間接熒光免疫標(biāo)記法、激光共聚焦顯微鏡觀察hIL-12在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，經(jīng)LSCM檢測，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯莖與塊莖中均有hIL-12的表達(dá)，而野生馬鈴薯中無hIL-12的表達(dá)。

6LSCM的應(yīng)用前景與展望

近年來出現(xiàn)的LSCM是一種圖像分析儀器，有著獨(dú)特的激光掃描成像方式及精確的計算機(jī)測量定位系統(tǒng)，其與電子顯微鏡、原子力顯微鏡、生物質(zhì)譜、核磁共振等技術(shù)不斷結(jié)合，大大提高了分辨率，是普通顯微鏡和電子顯微鏡的飛躍和補(bǔ)充，已經(jīng)深入生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域。但該技術(shù)還有一些不足，如價格昂貴、對操作人員技術(shù)要求高、激發(fā)波長有限等，限制了該技術(shù)的應(yīng)用。目前，該技術(shù)在藥用園藝植物方面的應(yīng)用也較少，但隨著時間的推移，該技術(shù)在園藝植物方面的研究將有更加廣闊的前景。

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收稿日期2015-12-28

作者簡介王健(1986-)，男，山東東阿人，碩士，研究方向：植物學(xué)。*通訊作者，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事植物學(xué)研究。

基金項目山東省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目[魯科農(nóng)(2012)65號]。

中圖分類號S 126

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)03-007-02