何　 茜，李儼書，李百祥*（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，黑龍江　 哈爾濱　 150081）

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阿特拉津?qū)D大鼠黑質(zhì)TH和Nurr1基因表達(dá)的影響

何 茜，李儼書，李百祥*
（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱 150081）

【摘要】目的： 探討阿特拉津(ATR)對(duì)大鼠多巴胺神經(jīng)元代謝途徑中相關(guān)因子表達(dá)的影響及多巴胺神經(jīng)元的損傷機(jī)制。方法：清潔級(jí)成年雄性SD大鼠68只，隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組和ATR 50、100、200 mg/kg劑量染毒組，每組17只。染毒組大鼠經(jīng)口灌胃ATR 28 d，取大鼠腦組織，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)和免疫組化檢測(cè)黑質(zhì)內(nèi)酪氨酸羥化酶(TH)與核受體相關(guān)因子1(Nurr1) mRNA和蛋白表達(dá)量的變化，采用 SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：qPCR結(jié)果顯示，用50、100和200 mg/kg濃度的ATR染毒的大鼠，其黑質(zhì)內(nèi)TH和Nurr1 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組比較明顯減少(P<0.05)，且存在劑量反應(yīng)關(guān)系。免疫組化結(jié)果顯示ATR染毒組大鼠黑質(zhì)中Nurr1、TH蛋白與對(duì)照組比較顯著降低(P<0.05)。結(jié)論：ATR可能通過(guò)影響多巴胺神經(jīng)元代謝途徑中的相關(guān)酶及其調(diào)控酶形成的基因致大鼠多巴胺神經(jīng)元損傷。

【關(guān)鍵詞】阿特拉津；多巴胺神經(jīng)元；酪氨酸羥化酶；核受體相關(guān)因子1

作者信息： 何 茜，E-mail：315069617@qq.com。*通信作者，李百祥，E-mail：libaix@ems.hrbmu.edu.cn

Effect of atrazine on expression of TH and Nurr1 genes in the substantia nigra of Sprague-Dawley rats

HE Xi，LI Yanshu，LI Baixiang*
(Department of Toxicology, College of Public Health, Harbin Medical University, Harbin 150081, Heilongjiang, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE: We evaluated the effects of atrazine(ATR) exposure in Sprague Dawley rat on the dopaminergic system. METHODS： Healthy adult male SD rats were randomly divided into four groups，control and ATR-dose (50，100，200 mg/kg) groups. Rats were treated orally with ATR for 28 d. The mRNA and protein expression of tyrosine hydroxylase (TH) and nuclear receptor-related factor 1 (Nurr1) were examined in samples of the substantia nigra by fluorescence PCR and immunohistochemistry. We use SPSS 17.0 to analyse the experimental results. RESULTS：qPCR results showed that with 50，100 and 200 mg/kg concentration of ATR exposure，rat substantia nigra TH and Nurr1 mRNA expression was significantly reduced compared with control group (P<0.05)，and there was a dose-response relationship. Immunohistochemistry showed that substantia nigra Nurr1 and TH proteins in treated-rats were significantly lower than those among the control group (P<0.05). CONCLUSION： The reduction of Nurr1 and TH suggests that ATR may influence the metabolism of dopamine neurons in dopaminergic neuron injury.

【KEY WORDS】atrazine；dopaminergic neurons；tyrosine hydroxylase；nuclear receptor-related factor 1

帕金森病 (Parkinson’s disease，PD)，也稱為震顫麻痹，是中老年人常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，也是中老年人最常見(jiàn)的錐體外系疾病，主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)紋狀體區(qū)的多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元生成減少[1]。迄今為止，PD的病因仍不清楚。目前的研究?jī)A向于與年齡老化、遺傳易感性和環(huán)境毒素的接觸等綜合因素有關(guān)，而在環(huán)境因素中又以各種環(huán)境污染物的作用尤為引人注意。在對(duì)黑龍江省佳木斯市的一個(gè)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)地區(qū)的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，最近幾年大量使用的農(nóng)藥除以往長(zhǎng)期使用的殺蟲劑、殺菌劑外，除草劑的使用呈上升的趨勢(shì)[2]，由于其對(duì)人、畜的毒性相對(duì)較小，但使用廣泛，人們對(duì)其的防范意識(shí)差。對(duì)其毒性的研究，尤其是對(duì)其神經(jīng)毒性的研究相對(duì)不足。阿特拉津(atrazine，ATR)是一種廣泛使用的均三氮苯類除草劑[3]，目前已在世界各國(guó)得到了大面積的推廣使用。ATR投入商業(yè)使用將近50年來(lái)，在一些地區(qū)地表水及地下水中大量殘留，有研究表明ATR的大量使用會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境構(gòu)成潛在的危害[4]。本課題組近年來(lái)也在研究ATR致多巴胺分泌減少及多巴胺能神經(jīng)元死亡機(jī)制的研究[5-7]，多巴胺神經(jīng)元的減少也是如帕金森，阿爾茲海默癥等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的重要因素。

酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)是一種兒茶酚胺類活性物質(zhì)生物合成的限速酶，在DA生物合成的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，是腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的蛋白標(biāo)志[8-9]。核受體相關(guān)因子1(nuclear receptor-related factor 1，Nurr1)是一種轉(zhuǎn)錄因子，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)特別是中腦組織表達(dá)，并對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)生發(fā)育起關(guān)鍵作用[10-13]。對(duì)Nurr1的研究中多以研究幼年期動(dòng)物為主，在發(fā)育的多巴胺能神經(jīng)元中的調(diào)節(jié)機(jī)制尚有爭(zhēng)議，在成年動(dòng)物體內(nèi)的作用研究較少[14-16]。本文擬通過(guò)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察ATR對(duì)成年大鼠多巴胺神經(jīng)元代謝途徑中的TH和Nurr1 mRNA與蛋白表達(dá)量的改變，探討ATR對(duì)多巴胺神經(jīng)元的損傷機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 清潔級(jí)成年雄性SD大鼠68只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。大鼠置于安靜的動(dòng)物房?jī)?nèi)籠養(yǎng)，控制室溫(22±2)℃，12 h/12 h晝夜循環(huán)光照。將大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(生理鹽水)，ATR 50、100、200 mg/kg劑量染毒組，每組17只。染毒組大鼠連續(xù)灌胃染毒28 d。

1.1.2 藥品和試劑 ATR(CAS 1912-24-9)，純度99.7%，購(gòu)自南京都萊生物技術(shù)有限公司。Prime Script?RT試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司?？?TH多克隆抗體，購(gòu)自德國(guó)Milopore公司。抗-Nurr1多克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Santa公司。免疫染色一抗稀釋液，購(gòu)自南京碧云天公司。山羊血清、山羊抗兔IgG、ABC kit、DAB顯色劑，均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)HERMLE公司。-80 ℃低溫冰箱，高壓滅菌裝置，SIM-F124制冰機(jī)均購(gòu)自日本Sanyo公司。80-2型離心機(jī)購(gòu)自上海手術(shù)器械廠。實(shí)時(shí)定量PCR儀ABI7500購(gòu)自美國(guó)ABI公司。冰凍切片機(jī)購(gòu)自美國(guó)AO Histostat Microtome公司。光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠黑質(zhì)TH和Nurr1 mRNA表達(dá)量 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative realtime PCR，qPCR)檢測(cè)各組Nurr1、TH mRNA的相對(duì)表達(dá)量，用Trizol試劑提取上述各組大鼠中腦黑質(zhì)總RNA，在GenBank中查找TH、Nurr1基因序列，通過(guò)Primer 3.0在線軟件設(shè)計(jì)引物。用含有GDNA Eraser 的Prime Script?RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行操 作，每個(gè)樣本加入3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行檢測(cè)。引物序列：β-actin，上游5′-GGAATCGTGCGTGACATTAAAG-3′，下游5′-CGG CAGTGCCATCTCTT-3′；TH，上游5′-AGCTGTGCAGC CCTCCAAGA-3′，下游5′-GTGTGTACGGGTCAAACTT CACAGA-3′；Nurr1，上游5′-CCAATCCGGCAATGAC CAG-3′，下游5′-TGATGATCTCCATAGAGCCAGTCAG -3′。PCR反應(yīng)條件： 94 ℃變性5 s，57.6 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共35個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)采用相對(duì)定量，由PCR反應(yīng)獲取閾值循環(huán)數(shù)(cycle threshold，CT) ，采取CT值比較法，即利用CT值 與起始cDNA濃度的對(duì)數(shù)成反比的數(shù)學(xué)關(guān)系，計(jì)算不同樣本之問(wèn)的相對(duì)百分比。公式：ΔΔCT=(CT，實(shí)驗(yàn)組目的基因-CT，實(shí)驗(yàn)組管家基因)-(CT，對(duì)照組目的基因-C)，目的mRNA的量=2-ΔΔCT。

T，對(duì)照組管家基因

1.2.2 組織切片的制備 每組取8只大鼠通過(guò)戊巴比妥鈉麻醉，用生理鹽水和4%多聚甲醛心臟灌注后，取腦組織置于4%多聚甲醛4 ℃固定8 h，用不同濃度梯度的蔗糖溶液(15%、30%)進(jìn)行脫水至沉底，取大鼠黑質(zhì)部位切片，委托哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理教研室進(jìn)行組織的冰凍切片制備。將組織吸干水分，用OTC包埋劑包埋組織，放于-20 ℃的冰凍切片機(jī)中作10 μm厚冰凍切片，進(jìn)行TH和Nurr1蛋白的免疫組化檢測(cè)，TH與Nurr1蛋白采用同一區(qū)域連續(xù)切片進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 免疫組化實(shí)驗(yàn) 切片用PBS清洗3次后，濾紙吸干周圍水分，同時(shí)滴入5%血清進(jìn)行室溫封閉30 min。吸去殘留血清加入1∶1 000的兔抗一抗進(jìn)行孵育，室溫1 h平衡后，4 ℃過(guò)夜。隔天取出切片37 ℃、45 min復(fù)溫后，用PBS清洗干凈，加入已稀釋好1∶1 000的二抗37 ℃進(jìn)行孵育30 min。PBS復(fù)洗3次，加入SP后進(jìn)行37 ℃恒溫反應(yīng)30 min。加入DAB顯色液進(jìn)行顯色后，用20、40倍物鏡顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.4 陽(yáng)性染色結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn) TH與Nurr1陽(yáng)性表達(dá)主要表現(xiàn)為細(xì)胞胞漿染色呈棕黃色。400倍顯微鏡下觀察黑質(zhì)部位，通過(guò)Image Pro-plus軟件計(jì)算圖片中蛋白表達(dá)的平均光密度，平均光密度=累積光密度/面積，用于反映組織中蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均以-x±s表示，各組間差異顯著性統(tǒng)計(jì)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各組之間參數(shù)比較采用單因素方差分析，以α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠黑質(zhì)TH和Nurr1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

qPCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。分別用50、100和200 mg/kg 的ATR連續(xù)灌胃染毒28 d 后，大鼠黑質(zhì)TH和Nurr1 m RNA相對(duì)表達(dá)水平均低于對(duì)照組(P<0.05)，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)隨ATR濃度增大其相對(duì)表達(dá)水平降低，存在劑量反應(yīng)關(guān)系。

表1 黑質(zhì)神經(jīng)元TH和Nurr1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

表1 黑質(zhì)神經(jīng)元TH和Nurr1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

與對(duì)照組比較，*P<0.05.

組別　TH mRNA　Nurr1 mRNA對(duì)照組　1.00±0.00　1.00±0.00 ATR 50 mg/kg　0.78±0.04*　0.85±0.26* 100 mg/kg　0.58±0.12*　0.50±0.08* 200 mg/kg　0.23±0.13*　0.21±0.11*

2.2 各組大鼠黑質(zhì)TH和Nurr1蛋白質(zhì)的表達(dá)量

ATR染毒后，各組大鼠黑質(zhì)均檢測(cè)到TH和Nurr1的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，見(jiàn)圖1和2。通過(guò)Image Pro-plus 軟件進(jìn)行定量分析得到各組平均光密度，見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，100和200 mg/kg ATR染毒組大鼠黑質(zhì)TH、Nurr1陽(yáng)性神經(jīng)元平均光密度明顯下降，且隨著ATR濃度增大而降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。

表2 黑質(zhì)神經(jīng)元TH和Nurr1蛋白的平均光密度

表2 黑質(zhì)神經(jīng)元TH和Nurr1蛋白的平均光密度

與對(duì)照組比較，*P<0.05.

組別　TH蛋白　Nurr1蛋白對(duì)照組　1.17±0.15　0.80±0.07 ATR 50 mg/kg　0.92±0.17　0.71±0.08 100 mg/kg　0.69±0.13*　0.62±0.12* 200 mg/kg　0.23±0.10*　0.29±0.11*

A：對(duì)照組；B：50 mg/kg ATR染毒組；C：100 mg/kg ATR染毒組；D：200 mg/kg ATR染毒組.圖1 免疫組化檢測(cè)ATR染毒后各組大鼠黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況(×200)

A：對(duì)照組；B：50 mg/kg ATR染毒組；C：100 mg/kg ATR染毒組；D：200 mg/kg ATR染毒組.圖2 免疫組化檢測(cè)ATR染毒后各組大鼠黑質(zhì)Nurr1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況(×200)

3 討 論

PD是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，65歲以上人群患病率為1 000/10萬(wàn)，隨年齡增高，男性稍多于女性。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，帕金森病的患病率存在地區(qū)差異，所以人們懷疑環(huán)境中可能存在一些有毒的物質(zhì)，損傷了大腦的神經(jīng)元[17-18]。ATR作為一種廣泛使用且在土壤和水體中可以長(zhǎng)期儲(chǔ)留并具有生物蓄積性的除草劑，不但對(duì)糧食和食品安全構(gòu)成了潛在威脅，而且會(huì)擾亂和破壞生物活性，對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響具有全球性。因此，深入研究ATR的風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題，已成為目前研究的熱點(diǎn)。在神經(jīng)系統(tǒng)，ATR可干擾大腦發(fā)育和分化，誘導(dǎo)小鼠行為反射的發(fā)育模式發(fā)生改變；抑制多巴胺的攝取和儲(chǔ)存，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[19]。由于ATR對(duì)多巴胺神經(jīng)元的損傷與帕金森病的神經(jīng)元損傷機(jī)制相似，因此我們推斷ATR有可能通過(guò)對(duì)黑質(zhì)紋狀體DA能神經(jīng)元的損傷作用而成為PD的環(huán)境化學(xué)因素之一。

酪氨酸羥化酶(TH)作為多巴胺合成的限速酶在多巴胺合成過(guò)程起到關(guān)鍵作用，TH免疫組織化學(xué)方法常被用于顯示DA能神經(jīng)元細(xì)胞體及其突起。Nurr1主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，與神經(jīng)前體細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元方向分化、成熟密切相關(guān)。Zetterstrom等[20]的研究表明，通過(guò)基因敲除技術(shù)，Nurrl基因缺陷的純合子小鼠(Nurrl-/-)紋狀體、中腦腹側(cè)部的TH和紋狀體多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)缺失，并且無(wú)多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生，新出生的雜合子小鼠(Nurrl+/-)的Nurrl蛋白和多巴胺水平明顯減少，這表明黑質(zhì)紋狀體多巴胺水平受Nurrl mRNA的劑量影響。Nurr1促進(jìn)DA能細(xì)胞分化的機(jī)制尚不清楚，但在多巴胺神經(jīng)元發(fā)育的過(guò)程中，Nurr1作用的唯一目的基因?yàn)門H。有研究證明，Nurr1可直接調(diào)控TH基因的啟動(dòng)子，在一些細(xì)胞類型，Nurr1被激活后，轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，結(jié)合到TH啟動(dòng)子內(nèi)的反應(yīng)原件，激活TH基因的轉(zhuǎn)錄[21]。我們的課題組也在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)在大腦發(fā)育早期，ATR可以穿過(guò)胎盤屏障對(duì)胚胎期大鼠的多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育產(chǎn)生影響。對(duì)胚胎期暴露大鼠黑質(zhì)內(nèi)TH、Nurr1、囊泡Ⅱ型轉(zhuǎn)運(yùn)體以及多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因和蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ATR可以通過(guò)抑制Nurr1的表達(dá)從而降低囊泡Ⅱ型轉(zhuǎn)運(yùn)體和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)量，破壞神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)多巴胺的正常轉(zhuǎn)運(yùn)和貯存，導(dǎo)致突出內(nèi)多巴胺含量的減少[5-6]。為探討ATR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)成年大鼠TH與Nurr1表達(dá)的影響和多巴胺神經(jīng)元的死亡機(jī)制，本研究通過(guò)對(duì)成年SD大鼠進(jìn)行經(jīng)口ATR染毒，觀察大鼠黑質(zhì)部位TH陽(yáng)性細(xì)胞與Nurr1陽(yáng)性細(xì)胞，研究結(jié)果顯示，隨著ATR染毒劑量的增加，大鼠黑質(zhì)內(nèi)TH陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度降低，對(duì)照組黑質(zhì)區(qū)可見(jiàn)較密集的棕褐色TH陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。Nurr1的免疫組化結(jié)果與TH相似，陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度均隨著染毒劑量的增加而降低。TH和Nurr1的mRNA與蛋白表達(dá)量均減少，這說(shuō)明ATR對(duì)成年期大鼠Nurr1和TH mRNA與蛋白合成造成影響，可能對(duì)多巴胺神經(jīng)元造成損傷作用。此結(jié)果可為深入研究ATR致多巴胺神經(jīng)元損傷機(jī)制提供有價(jià)值的資料，對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)環(huán)境因素在神經(jīng)退行性疾病如帕金森病、阿爾茲海默癥中的作用研究提供了毒理學(xué)依據(jù)。

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基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273109)

收稿日期：2015-10-12；

修訂日期：2015-12-15

中圖分類號(hào)：R114

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-616X(2016)01-0023-05

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.005