程 琳，孫平楠，3，謝慶東，2，周小玲，2，3，*（. 汕 頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞P2實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 5504；2. 汕 頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東 汕頭 5504；3. 廣 東省感染病與分子免疫病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 5504）

?

預(yù)擴(kuò)增qPCR方法檢測少量小鼠早期胚胎細(xì)胞中DNA甲基化相關(guān)基因的表達(dá)

程 琳1，2，3，孫平楠1，3，謝慶東1，2，周小玲1，2，3，*
（1. 汕 頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞P2實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515041；2. 汕 頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東 汕頭 515041；3. 廣 東省感染病與分子免疫病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515041）

【摘要】目的： 比較3種實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)方法對少量小鼠早期胚胎細(xì)胞中甲基化相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測效果，以期獲得適合日常檢測的方法。方法：分別應(yīng)用常規(guī)qPCR方法、基于等溫預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法、基于PCR預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法3種方案對少量小鼠早期胚胎細(xì)胞樣本中甲基化相關(guān)基因TET1、TET2、TET3、DNMT3A的mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果：3種方法的靈敏度由高到低依次為基于等溫預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法、基于PCR預(yù)擴(kuò)增qPCR方法、常規(guī)qPCR方法。前兩種方法均能在合適的循環(huán)數(shù)下對少量小鼠胚胎細(xì)胞中的多個(gè)甲基化相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行定量。而基于PCR預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法比基于等溫預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法更經(jīng)濟(jì)，適合日常檢測。因此，我們選擇應(yīng)用基于PCR預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法，檢測了小鼠卵細(xì)胞以及卵細(xì)胞受精后22 h甲基化相關(guān)基因表達(dá)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該過程中TET1表達(dá)量很低，不易檢測到；TET2表達(dá)呈降低趨勢；TET3和DNMT3A表達(dá)顯著升高(P<0.01)，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。結(jié)論：基于等溫預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法檢測少量細(xì)胞樣品中甲基化相關(guān)基因的表達(dá)的靈敏度在3種qPCR方法中最高。而基于PCR預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法操作簡單、靈敏度較高、成本相對低，適合少量細(xì)胞樣本中多個(gè)相關(guān)基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量日常檢測。

【關(guān)鍵詞】預(yù)擴(kuò)增；實(shí)時(shí)定量PCR；小鼠；早期胚胎細(xì)胞；甲基化相關(guān)基因

作者信息： 程 琳，E-mail：470751814@qq.com。*通信作者，周小玲，

Detection of expression of methylation-related genes in mouse early embryonic cells using pre-amplification-based real time quantitative PCR

CHENG Lin1，2，3，SUN Pingnan1，3，XIE Qingdong1，2，ZHOU Xiaoling1，2，3，*
(1. Stem Cell P2 Laboratory, Shantou University Medical College, Shantou 515041; 2. Reproductive Medicine Center, Shantou University Medical College, Shantou 515041; 3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Infectious Diseases and Molecular Immunopathology, Shantou 515041, Guangdong, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To identify a proper qPCR method for examining expression of methylation-related genes in mouse early embryonic cells. METHEDS：Normal qPCR，isothermal pre-amplification-based qPCR，and PCR pre-amplification-based qPCR methods were applied in quantitative assay of methylation-related genes (TET1，TET2，TET3 and DNMT3A) in mouse early embryonic cells. RESULTS：The sensitivity of these three methods decreased from isothermal pre-amplification-based qPCR method，PCR pre-amplification-based qPCR method to normal qPCR method. The former two methods detected expression of methylation-related genes in a few mouse embryonic cells within a proper PCR cycle number but the PCR pre-amplification-based qPCR method has lower cost than isothermal pre-amplification-based qPCR method. Therefore，we used PCR pre-amplification-based qPCR method to examine methylation-related genes in mouse oocytes and early embryonic cells after 22 h fertilization. The results showed that the expression level of TET1 mRNA was very low and not detectable，the expression of TET2 decreased，and the expression of TET3 and DNMT3A significantly increased (P<0.01) in this process，which was consistent with reported results.

CONCLUSION：The sensitivity of isothermal pre-amplification-based qPCR method was the highest among the three qPCR methods. However，the PCR pre-amplification-based qPCR method is the most suitable one for examining multigene expression in a few cells in daily practice due to the simple procedure， relatively high sensitivity and lowexpenditure.

【KEY W ORDS】pre-amplification；real t ime q uantitative P CR；mouse；early e mbryonic c ell；methylation-related g enes

在哺乳動物合子以及早期胚胎細(xì)胞發(fā)育過程中，甲基化相關(guān)基因和其他早期發(fā)育相關(guān)的基因起到重要作用，且具有特定的時(shí)空表達(dá)譜，因此其表達(dá)變化情況成為研究中關(guān)注的重點(diǎn)[1-3]。行使甲基化功能的甲基轉(zhuǎn)移酶主要包括DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1 ，DNMT1)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNMT3A)、DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)。DNMT1可催化一條鏈甲基化的DNA雙鏈中的未甲基化鏈，使其完全甲基化；而DNMT3A、DNMT3B則催化未甲基化的DNA雙鏈從頭甲基化。DNA胞嘧啶甲基化后形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。行使去甲基化功能的酶類有Tet家族成員，包括甲基胞嘧啶雙加氧酶-1( ten-eleven translocation methyl cytosine dioxygenase 1，TET1)、甲基胞嘧啶雙加氧酶-2(TET2)、甲基胞嘧啶雙加氧酶-3(TET3)。TET蛋白主要通過催化5-mC轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)，還能進(jìn)一步氧化5-hmC生成一系列衍生物，最終形成無甲基化修飾的胞嘧啶，是DNA去甲基化過程中的一種重要的酶，對于維持干細(xì)胞的多能性有重要作用。

現(xiàn)階段，由于在研究中獲得的哺乳動物胚胎細(xì)胞的數(shù)量有限，應(yīng)用常規(guī)實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative realtime PCR，qPCR)對少量胚胎細(xì)胞中甲基化或發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行定量檢測往往未能檢測到信號，或者即使檢測到信號，qPCR循環(huán)數(shù)也過多，從而導(dǎo)致處理組與對照組之間比較時(shí)可信度并不高。此外，由于起始細(xì)胞量少、所含的總RNA量也少，因此反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA量不能滿足下游檢測需要。這種情況下采用常規(guī)qPCR往往只能對1~2個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行檢測(每個(gè)基因包括內(nèi)參均還需要有重復(fù)組)，從而無法同時(shí)對5～10個(gè)基因甚至更多的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測。

近年來，對于少量細(xì)胞樣本甚至是單細(xì)胞樣本的RNA深度測序技術(shù)有了很大的提高。有研究人員采用PCR預(yù)擴(kuò)增或者基于Phi-29酶的等溫預(yù)擴(kuò)增技術(shù)從少量樣本中預(yù)先擴(kuò)增獲得了足量的cDNA來完成后續(xù)測序工作[4-5]。PCR預(yù)擴(kuò)增方法主要是在對少量樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后進(jìn)行少量循環(huán)(6～12個(gè)循環(huán))的PCR預(yù)擴(kuò)增以獲得足量的相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)定量檢測[5]；基于Phi-29酶的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是在對少量樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，對獲得的cDNA加接頭連接環(huán)化后，再用Phi-29酶對其進(jìn)行等溫線型擴(kuò)增[4]。后者相對前者而言，由于能線性擴(kuò)增較長片段的cDNA，故能夠更加準(zhǔn)確真實(shí)的反映少量細(xì)胞樣品中各個(gè)基因的表達(dá)量[4]。然而，現(xiàn)階段后者中用到的相關(guān)試劑價(jià)格較昂貴，這也限制了實(shí)際研究中對細(xì)胞數(shù)目有限的材料中多個(gè)目的基因的表達(dá)同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量日常檢測。

因此，我們針對少量哺乳動物早期胚胎細(xì)胞樣本中與甲基化相關(guān)的多個(gè)基因(TET1、TET2、TET3、DNMT3A等)的定量檢測，比較了常規(guī)qPCR方法、基于等溫預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法和基于PCR預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法3種方案的檢測結(jié)果，為今后相關(guān)研究工作的開展提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

PMSG和HCG購自寧波三生藥業(yè)有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace qPCR RT Kit，F(xiàn)SQ-101)購自Toyobo公司。qPCR試劑盒(Quantifast SYBR Green PCR Kit)和純化試劑盒(QIAquick PCR purification Kit)均購自Qiagen公司。PCR試劑盒(Premix Taq? Hot Start Version，R028A)購自Takara公司。

經(jīng)回顧性分析可知，引發(fā)胎兒先天性心臟病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素與孕早期感冒、負(fù)性生活事件和生殖系統(tǒng)感染存在相關(guān)性，同時(shí)與居住環(huán)境有著直接關(guān)系，見表2。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

采用汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究中心飼養(yǎng)培育的清潔級昆明品系小鼠，雌鼠為8~10周齡，雄鼠10~12周齡。

1.3 體外授精

處死雄鼠，取附睪置于含有0.3% BSA的TYH培養(yǎng)基中，將附睪剪碎，加入1 mL培養(yǎng)基，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中上游5 min。上游后600 g離心5 min，棄上清，加入1.5 mL獲能液(3.5% BSA)重懸精子后置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱獲能1 h。600 g離心5 min，棄去部分培養(yǎng)基，用剩余培養(yǎng)基重懸精子制作精子液滴，按每滴50 μL，覆以甘油，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中。雌鼠皮下注射10 IU PMSG，48 h后腹腔注射10 IU HCG誘導(dǎo)超排。HCG注射12~16 h后取出輸卵管，將輸卵管置于含有0.3% BSA的TYH培養(yǎng)基中，鏡下刺破壺腹部并擠壓，使卵丘細(xì)胞浸在培養(yǎng)基中將其轉(zhuǎn)入含有0.1%透明質(zhì)酸酶的TYH中，洗滌卵細(xì)胞2次將卵母細(xì)胞移入受精液滴，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h以獲得早期胚胎細(xì)胞。

1.4 卵細(xì)胞、胚胎細(xì)胞的收集

分別收集30個(gè)卵細(xì)胞或30個(gè)早期胚胎細(xì)胞，用PBS洗滌2次，把洗滌后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至裝有20 μL細(xì)胞裂 解緩沖液(cells-to-cDNATMⅡ Kit，Ambion)的EP管中，75 ℃ ，5 m in，放置于冰上5 m in，加入1.5 μ L D Nase 1 ，短暫離心后，37 ℃，30 min，置于冰上10 min， 然后75 ℃加熱5 min。

1.5 qPCR的3種方案

1.5.1 常規(guī)qPCR方法 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將裂解后的產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件為：37 ℃、15 min；98 ℃、5 min。產(chǎn)物稀釋10倍后進(jìn)行qPCR。

1.5.2 基于等溫預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法 具體步驟見參考文獻(xiàn)[4]。簡而言之，先將細(xì)胞裂解產(chǎn)物去除基因組DNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再將其進(jìn)行平端連接，然后用phi-29酶對其進(jìn)行擴(kuò)增。最終產(chǎn)物純化后稀釋100倍進(jìn)行qPCR。

1.5.3 基于PCR預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法 步驟見參考文獻(xiàn)[5]。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將裂解后的產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件為：37 ℃、15 min；98 ℃、5 min。用PCR試劑盒對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行以下處理：Premix 12.5 μL，目的正、反向引物各1 μL，DNA模板10 μL，最后加水至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃、5 min；98 ℃、10 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，10個(gè)循環(huán)；72 ℃、7 min擴(kuò)增。然后用純化試劑盒對上述RTPCR的產(chǎn)物進(jìn)行純化。獲得的純化產(chǎn)物稀釋10倍后進(jìn)行qPCR。

將以上3種不同方案的cDNA產(chǎn)物按照qPCR試劑盒進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：SYBR(2×) 10 μL，目的正、反向引物各1 μL，cDNA模板8 μL，總量20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、5 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列為：TET1正向引物5′-CCAT TCTCACAAGGACATTCACA-3′，反向引物5′-GCAGG ACGTGGAGTTGTTCA-3′，跨內(nèi)含子611 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物116 bp；TET2正向引物5′-GCCATTCTCAGGAGTCACT GC-3′，反向引物5′-ACTTCTCGATTGTCTTCTCTATTG AGG-3′，跨內(nèi)含子1 700 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物120 bp。TET3正向引物5′-GGTCACAGCCTGCATGGACT-3′，反向引物5′-AGCGATTGTCTTCCTTGGTCAG-3′，跨內(nèi)含子2 474 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物104 bp；DNMT3A正向引物5′-ATGT GGTTCGGAGATGGCAAG-3′，反向引物5′-AGATGGC TTTGCGGTACATGG-3′，跨內(nèi)含子429 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物124 bp； RSP6(正向引物5′-AGGAGAGAAGGATATTCCTGG AC-3′，反向引物5′-GCTTCCTGACAACATACTG GC-3′)作為內(nèi)參[6]。目的基因的表達(dá)水平與內(nèi)參相比后采用2-ΔΔCT方法計(jì)算。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.6 瓊脂糖凝膠電泳

1%的凝膠，電壓至120 V，電泳30 min后，取出凝膠，在數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)下照相記錄電泳圖譜。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

小鼠卵細(xì)胞和早期胚胎細(xì)胞中甲基化相關(guān)基因的表達(dá)水平差異分析采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 3種qPCR方案擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

采用3種qPCR方案分別對30個(gè)受精后22 h的小鼠早期胚胎細(xì)胞中甲基化和去甲基化相關(guān)的基因TET1、TET2、TET3、DNMT3A進(jìn)行擴(kuò)增獲得擴(kuò)增曲線(圖1)和循環(huán)閾值(CT值 )(表1)。從擴(kuò)增曲線以及CT值 來看，基于PCR預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法的擴(kuò)增效果優(yōu)于常規(guī)qPCR方法，更接近于基于等溫預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法。

表1 3種qPCR方案擴(kuò)增小鼠早期胚胎細(xì)胞中DNA甲基化相關(guān)基因的CT值

2.2 3種方案的擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

分別將3種方案擴(kuò)增的qPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖2)。各方案的電泳圖中擴(kuò)增產(chǎn)物亮度與各方案在qPCR結(jié)果中呈現(xiàn)的靈敏度相一致，常規(guī)qPCR方法中TET1基因未擴(kuò)增出來，TET2、TET3、DNMT3A和RSP6有擴(kuò)增條帶，但是比基于等溫預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法和基于PCR預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法的條帶明顯要弱。就基因擴(kuò)增效果而言，基于等溫預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法>基于PCR預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法>常規(guī)qPCR方法，而就實(shí)驗(yàn)費(fèi)用而言，基于PCR預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法要遠(yuǎn)低于基于等溫預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法。因此，我們選擇基于PCR預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 基于PCR預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法定量檢測小鼠卵細(xì)胞受精后TET1、TET2、TET3和DNMT3A的基因表達(dá)變化

我們采用基于PCR預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法對小鼠卵細(xì)胞及受精后22 h的早期胚胎中去甲基化基因TET1、TET2和TET3和甲基化基因DNMT3A的表達(dá)變化進(jìn)行了快速定量檢測。結(jié)果顯示小鼠卵細(xì)胞中去甲基化基因TET2和TET3和甲基化基因DNMT3A相對于內(nèi)參RSP6的表達(dá)量分別是0.02±0.00、3.30±0.16、0.25±0.02；受精后22 h的早期胚胎細(xì)胞中TET2和TET3和甲基化基因DNMT3A相對于內(nèi)參RSP6的表達(dá)量分別是0.01± 0.00、4.30±0.35、1.90±0.23。TET1表達(dá)量太低未檢測出(圖3)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，小鼠卵細(xì)胞體外受精后22 h的過程中TET2表達(dá)水平略下降、TET3和DNMT3A在該過程中表達(dá)則顯著增加(P<0.05)。獲得的結(jié)果和變化趨勢與Yan等[6]的深度測序結(jié)果、Iqbal等[3]以及Wossidlo等[7]報(bào)道的qPCR結(jié)果基本一致。

A：TET1的擴(kuò)增曲線；B：TET2的擴(kuò)增曲線；C：TET3的擴(kuò)增曲線；D：DNMT3A的擴(kuò)增曲線；E：內(nèi)參RPS6的擴(kuò)增曲線. 藍(lán)色線代表基于等溫預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法，橙色線代表基于PCR預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法，綠色線代表常規(guī)qPCR方法.圖1 少量小鼠胚胎細(xì)胞樣本分別采用3種qPCR方案的基因擴(kuò)增曲線

M1、M2、M3分別代表常規(guī)qPCR方法、基于等溫預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法和基于PCR預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法.圖2 3種方案的qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 小鼠卵細(xì)胞和早期胚胎細(xì)胞TET1、TET2、TET3和DNMT3A的相對表達(dá)水平變化

3 討 論

研究中基于少量細(xì)胞樣本的基因表達(dá)水平檢測，往往難以實(shí)現(xiàn)同時(shí)對多個(gè)基因的檢測。近年發(fā)展起來的基于PCR預(yù)擴(kuò)增或者基于等溫預(yù)擴(kuò)增的對少量細(xì)胞或單細(xì)胞基因表達(dá)檢測的方法，為該問題的解決提供了有利的工具[4-5]。雖然后者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確，但因?yàn)槭軐?shí)驗(yàn)成本較高等因素影響，其在日常檢測中的應(yīng)用受到限制。我們研究發(fā)現(xiàn)，基于PCR預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法定量檢測少量樣本細(xì)胞中基因表達(dá)獲得的qPCR擴(kuò)增曲線與基于等溫預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法更接近，而采用常規(guī)qPCR方法對于少量細(xì)胞樣本中的基因進(jìn)行檢測獲得的CT值 與其他兩種方法相比偏高，不利于少量樣本的準(zhǔn)確定量檢測。我們進(jìn)一步采用建立的基于PCR預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法對小鼠卵細(xì)胞到卵細(xì)胞受精后22 h的早期胚胎過程中重編程相關(guān)基因TET1、TET2、TET3和DNMT3A的mRNA表達(dá)水平變化情況。結(jié)果顯示在該過程中TET1表達(dá)量很低，不易檢測到；TET2表達(dá)呈下降趨勢；TET3和DNMT3A表達(dá)升高，這與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[3，6-7]。TET1是胚胎發(fā)育后期的關(guān)鍵調(diào)控因子在合子和二細(xì)胞中表達(dá)量少，而TET3僅在合子和二細(xì)胞胚胎階段高表達(dá)[8]。因此，與常規(guī)qPCR流程相比，基于PCR預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法更接近基于等溫預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法，亦即更準(zhǔn)確，同樣的起始樣本量可以同時(shí)檢測更多的基因；與基于等溫預(yù)擴(kuò)增的qPCR方法相比，更易于在日常檢測中使用。

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基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81570567，81571994)；廣東省自然科學(xué)基金(2014A030313483，2015A030313447)；教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金(第49批)；汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院李嘉誠基金

收稿日期：2015-05-05；

修訂日期：2015-12-24

中圖分類號：Q781

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-616X(2016)01-0051-05

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.011