方　 芳，王　 靜，馬彩玲*（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，新疆 烏魯木齊　 830054）

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miR-34a在新疆維吾爾族和漢族婦女不同宮頸病變組織中的表達及臨床意義

方 芳，王 靜，馬彩玲*
（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，新疆 烏魯木齊 830054）

【摘要】目的： 檢測miR-34a在新疆維吾爾族和漢族婦女不同宮頸病變組織中的表達情況，并探討其與宮頸癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系及其臨床意義。方法：采用實時熒光定量PCR檢測58例宮頸癌、60例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅱ~Ⅲ級和32例健康對照組織中miR-34a的表達，分析其在維吾爾族、漢族婦女不同宮頸病變中的表達差異及與宮頸癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，繪制受試者工作曲線(ROC)分析miR-34a作為宮頸癌腫瘤標(biāo)記的診斷價值。結(jié)果：miR-34a在維吾爾族和漢族婦女宮頸癌組織中的表達均顯著低于CINⅡ~Ⅲ級和健康對照組織(P<0.05)，同類宮頸病變組織維吾爾族和漢族婦女間表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。miR-34a的表達與腫瘤直徑、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.01)，與年齡、腫瘤分化程度、病理類型等無顯著相關(guān)(P>0.05)。miR-34區(qū)分宮頸癌與健康者、CINⅡ~Ⅲ級患者時，曲線下面積(AUC)分別為0.889(靈敏度87.5%，特異度81.0%)和0.767(靈敏度78.3%，特異度70.7%)，從所有受試者中區(qū)分出宮頸癌患者的AUC為0.810(靈敏度83.7%，特異度70.7%)。結(jié)論：miR-34a參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，在宮頸癌組織中表達明顯下調(diào)，且無種族表達差異，可能成為宮頸癌診斷及病情預(yù)測的新型分子標(biāo)記。

【關(guān)鍵詞】miR-34a；宮頸癌；臨床特征；ROC曲線；維吾爾族

作者信息：方 芳，E-mail：15459122@qq.com。*通信作者，馬彩玲，E-mail：h ymcl@sina.com

Expression of miR-34a in different types of cervical lesions from Uyghur and Han women in Xinjiang and its clinical significance

FANG Fang，WANG Jing，MA Cailing*
(Department of Gynecology, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To investigate the expression of miR-34a in different types of cervical lesions from Uyghur and Han women in Xinjiang，and to explore its association with clinicopathologic parameters of cervical carcinoma and its clinical value. METHODS：Quantitative real-time PCR was used to detect miR-34a expression in 58 specimens of cervical carcinoma，60 specimens of cervical intraepithelial neoplasia Ⅱ-Ⅲ level (CINⅡ-Ⅲ level)and 32 specimens of healthy control tissue. Data were used to analyze correlations between the expression levels of miR-34a in cervical lesions to different degrees of Uyghur and Han women and related clinicopathologic parameters of cervical carcinoma. Receiver operating characteristic curve (ROC curve) were used to analyze the ability of potential biomarkers to determine cervical carcinoma. RESULTS：The expression of miR-34a in cervical carcinoma was statistically significantly lower than those in CINⅡ-Ⅲ level and healthy control tissue (P<0.05)，but no obvious difference was detected between women with Uyghur and Han ethnicities (P>0.05). The expression of miR-34a was associated with the tumor size and FIGO stage and lymph node metastasis (P<0.01). No significant associations were found between miR-34a level and other clinicopathologic parameters of cervical carcinoma，such as age，differentiation，pathological types (P>0.05). miR-34a yielded a receiver-operator characteristic curve area(AUC) of 0.889 (sensitivity 87.5% and specificity 81.0%) to discriminating cervical carcinoma patients from healthy controls and 0.767 (sensitivity 78.3% and specificity 70.7%) to discriminating patients with cervical carcinoma from CINⅡ-Ⅲ level patients and 0.810 (sensitivity 83.7% and specificity 70.7%) to determining cervical carcinoma from all cases. CONCLUSION：Expression of miR-34a was similar for thedifferent ethnic groups. Down-regulation of miR-34a may be involved in the oncogenesis and development of cervical carcinoma. T herefore，miR-34a may b e u seful a s a novel biomarker for early diagnosis and prognosis monitoring.

【KEY WORDS】miR-34a；cervical carcinoma；clinicopathologic features；receiver operating characteristic curve；Uyghur

宮頸癌(cervical carcinogenesis，CC)是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，世界范圍內(nèi)，宮頸癌發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第1位，死亡率居女性惡性腫瘤第2位[1]。我國宮頸癌發(fā)病率居世界第2位，新疆為我國宮頸癌高發(fā)地區(qū)，維吾爾族婦女的病死率居各民族之首[2]。宮頸癌惡性程度高、易轉(zhuǎn)移侵襲，預(yù)后差。早期常無明顯癥狀和體征，易漏診和誤診。因此，探索宮頸癌發(fā)生發(fā)展機制，尋求靈敏度高和特異性強的腫瘤標(biāo)記物對于宮頸癌的早期診斷、分期鑒別、靶向治療、病情監(jiān)測及預(yù)后評估等具有重要意義。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類具有高度保守性、時序性和特異性的非編碼單鏈小分子RNA，長度約18~25個核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白編碼基因，參與腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡等過程，作為癌基因或抑癌基因影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-5]。miR-34a定位于人類染色體1p36.23，直接受經(jīng)典抑癌基因p53調(diào)控，參與p53信號通路，在腫瘤組織細胞中易缺失或失活，與結(jié)腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。目前miR-34a與宮頸癌的關(guān)系報道甚少，其在新疆維吾爾族和漢族間表達差異關(guān)系的研究未見報道。為此，本研究運用實時熒光定量PCR技術(shù)(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測miR-34a在新疆維吾爾族和漢族婦女不同宮頸病變組織中的表達情況，初步探討miR-34a在不同宮頸病變組織中的差異表達，及其與宮頸癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系和對宮頸癌診斷的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2010年11月-2013年2月期間在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科住院手術(shù)治療并經(jīng)術(shù)后病理確診的維吾爾族和漢族婦女不同宮頸病變石蠟組織標(biāo)本，排除急性炎癥或嚴(yán)重慢性疾病患者，妊娠哺乳婦女，接受過放化療、局部藥物及其他治療者。由本院兩名病理科醫(yī)生獨立閱片復(fù)核后最終納入150例，其中宮頸癌58例(為根治性全子宮切除術(shù)及盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)者標(biāo)本)，宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅱ~Ⅲ級60例，健康對照組32例(因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)的正常宮頸組織)。宮頸癌組維吾爾族25例，漢族33例，年齡32~79歲，中位年齡50.0歲；CIN組維吾爾族26例，漢族34例，年齡28~75歲，中位年齡44.0歲；健康對照組維吾爾族15例，漢族17例，年齡30~71歲，中位年齡40.5歲。各組間及組內(nèi)維吾爾族和漢族病例之間年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 miRNeasy FFPE試劑盒、miScript II 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miScript SYBR Green PCR Kit實時熒光定量PCR試劑盒均購自德國QIAGEN公司。miR-34a及內(nèi)參U6引物序列由上海生工公司合成。RGQ-5PLEX HRM實時熒光定量PCR 儀為德國QIAGEN公司產(chǎn)品，NanoDrop2000分光光度計為Thermo公司產(chǎn)品。

1.2.2 組織總RNA提取及檢測 按照miRNeasy FFPE試劑盒說明書步驟提取石蠟組織總RNA， NanoDrop 2000分光光度計測定RNA吸光度D(260)及D(280)值，計算濃度和純度，D(260)/D(280)比值為1.8~2.0可用于逆轉(zhuǎn)錄。1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測組織miRNA 應(yīng)用miScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件為37 ℃、60 min，95 ℃、5 min，-20℃保存。1∶30稀釋cDNA，以U6為內(nèi)參，按照miScript SYBR Green PCR試劑盒說明書，配置20 μL反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，2×SYBR Green Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，無核酸水7 μL。miR-34a引物序：上游5′-TGCGCTGGCAGTGTCTTAGCT-3′，下游5′-CC AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；U6引物序列：上游5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游5′-AAATAT GGAACGCTTCACGA-3′。熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性15 s、55 ℃退火30 s、70 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；在70 ℃收集熒光信號，循環(huán)結(jié)束后60~95 ℃繪制熔解曲線。每個樣本檢測均重復(fù)3次，設(shè)空白對照。繪制擴增曲線，記錄每個反應(yīng)管中的熒光信號達到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即CT值 ，采用相對-定量比較CT法 ：-△△CT=(CT，實驗組目的基因-CT，實驗組內(nèi)參基因)-( CT，對照組目的基因-CT，對照組內(nèi)參基因)，計算出miR-34a基因相對表達量=2－△△CT。

1.2.4 繪制受試者工作曲線 以敏感度為縱坐標(biāo)，(1-特異性)為橫坐標(biāo)繪制受試者工作曲線(receiver operator characteristic，ROC)，計算曲線下面積(areaunder curve，AUC)，并根據(jù)最大Youden指數(shù)選擇miR-34a作為腫瘤標(biāo)記物的臨界值。分析miR-34a用于診斷宮頸癌的靈敏度和特異度，靈敏度、特異度越高，曲線下面積越大，診斷準(zhǔn)確性越高。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理。miR-34a 相對表達量資料呈偏態(tài)分布，采用中位數(shù)M與四分位數(shù)間距(QL~QU) 表示。不同宮頸病變獨立樣本組間比較及宮頸癌臨床病理指標(biāo)組間比較采用非參數(shù)檢驗，Spearman秩相關(guān)性分析研究相關(guān)性，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 miR-34a在不同宮頸病變組織中的表達

miR-34a在維吾爾族和漢族婦女不同宮頸病變組織中的表達見表1。miR-34a在宮頸癌組中的表達量明顯低于CINⅡ~Ⅲ組及健康對照組，表現(xiàn)為健康對照組> CINⅡ~Ⅲ組>宮頸癌組的逐漸下降趨勢，3組間表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=25.123；χ2= 25.801，P=

維吾爾族漢族0.000)，進一步兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同一種宮頸病變組織中，維吾爾族與漢族miR-34a表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 miR-34a在不同宮頸病變組織中的表達

2.2 miR-34a表達水平與宮頸癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

miR-34a的表達與宮頸癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系見表2。miR-34a表達水平與患者年齡、腫瘤分化程度、病理類型、肌層浸潤、宮旁浸潤均無關(guān)(P>0.05)，但與腫瘤直徑、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.01)。miR-34a表達量在腫瘤直徑>4 cm者中明顯低于腫瘤直徑≤4 cm者，表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-3.115，P=0.002)。比較不同F(xiàn)IGO分期患者，Ⅲ~Ⅳ期患者miR-34a表達量較Ⅰ期及Ⅱ期患者明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.160，P=0.001)。與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者miR-34a明顯低表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.797，P=0.005)。進一步進行Spearman秩相關(guān)性分析，miR-34a表達水平與腫瘤直徑呈負相關(guān)(r=-0.413，P=0.001)，與FIGO分期負相關(guān)(r=-0.491，P=0.000)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移負相關(guān)(r=-0.370，P=0.004)。

2.3 miR-34a檢測在宮頸癌診斷中的價值

ROC曲線分析顯示miR-34a區(qū)分宮頸癌與健康者的AUC為0.889(95%CI：0.814~0.957，P=0.000)，以miR-34a 表達量0.406為評價臨界值，靈敏度87.5%，特異度81.0%(圖1A)；將宮頸癌從所有受試者中區(qū)分出來的AUC為0.810(95%CI：0.737~0.882，P=0.000)，以miR-34a表達量0.211為臨界值，靈敏度83.7%，特異度70.7%(圖1B)，表現(xiàn)出較高的診斷價值。而區(qū)分宮頸癌與CINⅡ~Ⅲ患者的AUC為0.767(95%CI：0.680~0.854， P=0.000)，以miR-34a表達量0.211為臨界值，靈敏度78.3%，特異度70.7%，診斷價值中等(圖1C)。

表2 miR-34a的表達與宮頸癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

A：miR-34a作為標(biāo)記區(qū)分宮頸癌與健康者的ROC曲線；B：miR-34a作為標(biāo)記從所有受試者中區(qū)分出宮頸癌的ROC曲線；C：miR-34a作為標(biāo)記區(qū)分宮頸癌與CINⅡ~Ⅲ級患者的ROC曲線.圖1 miR-34a作為腫瘤標(biāo)記診斷不同宮頸病變的ROC曲線

3 討 論

宮頸癌為女性常見惡性腫瘤，近年來發(fā)病率逐漸上升并呈年輕化趨勢。目前宮頸癌的治療仍以手術(shù)為主，放化療為輔，宮頸癌易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，5年生存率，早期癌90%，晚期僅為66%[7]。宮頸癌是多因素、多步驟及長期作用的結(jié)果，因此，探究宮頸癌發(fā)生發(fā)展機制對于疾病的早期診治，提高患者生存率極其重要。miRNA是目前腫瘤研究的熱點領(lǐng)域，成熟miRNA形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物RISC，與下游特定靶基因mRNA堿基互補配對，抑制蛋白翻譯，參與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲等，在腫瘤的不同進展階段具有不同的表達譜，可作為腫瘤標(biāo)記物進行早期診斷及判斷預(yù)后等[8-10]。

miR-34a最早在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，是進化保守miR-34家族中的一員。業(yè)已公認，經(jīng)典抑癌基因p53的突變或缺失與人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。對乳腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)miR-34a基因序列上游約30 kb的啟動子區(qū)域存在高度保守的p53蛋白結(jié)合位點，決定了p53對miR-34a的直接誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，同時受miR-34a的正反饋調(diào)控作用。研究報道，p53基因調(diào)控CDK4、CDK6、c-myc、C-MET、CyclinE2、Bcl-2等蛋白[11-13]。E2F基因組為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在細胞周期的G1/S期轉(zhuǎn)變過程發(fā)揮重要作用，miR-34a可直接靶向結(jié)合p53-miR-34a-E2F3-p53通路中E2F3基因3′UTR，下調(diào)E2F3表達上調(diào)p53，正反饋激活miR-34a表達，抑制細胞增殖[14-15]。miR-34a靶向抑制沉默信號調(diào)節(jié)子1，活化p53表達，形成p53-miR-34a-SIRT1-p53正反饋通路，增強放大miR-34a自身及p53作用，促進細胞周期G1期阻滯及細胞衰老凋亡[16]。miR-34a的失活或缺失可能與腫瘤的發(fā)病機制有關(guān)。Osawa等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a在胃癌前病變-早期胃癌-進展期胃癌中呈動態(tài)升高趨勢，miR-34a在胃癌組織中高表達，可作為胃癌的預(yù)后判斷指標(biāo)。

為探討miR-34a在宮頸癌組織中的表達，本研究應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了維吾爾族和漢族不同宮頸病變組織中miR-34a的表達水平，結(jié)果顯示維吾爾族及漢族婦女宮頸癌組織中miR-34a的表達均顯著低于健康對照組織及CINⅡ~Ⅲ級組織(P<0.01)，并隨健康對照組、CINⅡ~Ⅲ級、宮頸癌病變級別的升高呈動態(tài)下降趨勢。miR-34a低表達與宮頸癌惡性程度顯著相關(guān)，腫瘤直徑越大、FIGO分期級別越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，惡性程度越高，miR-34a表達量越低。提示miR-34a可能作為抑癌基因參與宮頸癌形成的早期事件，miR-34a的低表達可能削弱了對腫瘤細胞周期進展及凋亡的控制，導(dǎo)致腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，初步揭示了miR-34a在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。臨床中，宮頸原位癌及微小浸潤癌可無明顯病灶，宮頸活檢存在取材局限，漏診可能，檢測miR-34a表達量可能作為癌前病變及早期宮頸癌的監(jiān)測指標(biāo)，以提高早期診斷率。miR-34a隨宮頸癌惡性程度改變而呈現(xiàn)表達水平的變化，可能為宮頸癌靶向治療提供新的策略和良好的預(yù)后判斷指標(biāo)。在本研究結(jié)果中，miR-34a的表達與臨床分期相關(guān)，與宮旁浸潤無關(guān)，一方面考慮與樣本量較少，存在樣本偏倚可能，另一方面宮旁浸潤為臨床分期的重要指標(biāo)，但浸潤區(qū)域范圍，有無腎盂積水或膀胱直腸黏膜轉(zhuǎn)移等也與宮頸癌的臨床分期相關(guān)，考慮可能為多因素共同影響miR-34a在不同臨床分期中的表達差異，而單一宮旁浸潤表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可待后期進一步研究。

Andersen等[18]采用qPCR技術(shù)對惡性胸膜間皮瘤(MPM)患者和正常人組織樣本中miR-145檢測，提出miR-145可作為篩查MPM的生物標(biāo)記。本研究在檢測miR-34a表達水平的基礎(chǔ)上，進一步ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，miR-34a區(qū)分宮頸癌與健康者時靈敏度87.5%， 特異性81.0%，從所有受試人群中區(qū)分宮頸癌時，靈敏度83.7%，特異性70.7%，均表現(xiàn)出較高的診斷價值，提示miR-34a具有作為腫瘤標(biāo)記的潛力。

新疆維吾爾族婦女宮頸癌高發(fā)，本研究比較了維吾爾族婦女與漢族婦女miR-34a表達水平，結(jié)果顯示表達無種族差異(P>0.05)，表明維吾爾族宮頸癌高發(fā)與miR-34a表達水平無關(guān)，可能與種族間的基因多態(tài)性顯著差異引起遺傳易感有關(guān)[19]，有待研究。此外，流行病學(xué)研究指出維吾爾族特有的生活習(xí)性、較低的經(jīng)濟水平和腫瘤預(yù)防意識淡薄等社會因素也與其高發(fā)病率有關(guān)[2]。

綜上所示，miR-34a在宮頸癌中低表達，參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，可能成為宮頸癌診斷及病情預(yù)測的分子標(biāo)記。本研究為回顧性研究，利用FFPE樣本作miRNA表達譜分析具有很好的準(zhǔn)確性和實用性[20]，因而我們選取較易獲取的FFEP標(biāo)本進行了本實驗，初步揭示了miR-34a在宮頸癌組織中的差異表達，為后續(xù)擴大樣本量，進一步從蛋白水平分析宮頸病變組織表達差異及相關(guān)作用機制等研究奠定了基礎(chǔ)。

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基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81160278)

收稿日期：2015-11-05；

修訂日期：2015-12-16

中圖分類號：R737.3

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-616X(2016)01-0041-05

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.009