唐 嬌趙 敏楊 穎李 慶黃俊明*楊杏芬*（. 廣 東省疾病預防控制中心衛(wèi)生毒理所廣東 廣州 5430；2. 廣 東省生物制品與藥物研究所藥理研究室廣東 廣州 50440）

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三七的急性毒性及致突變性試驗研究

唐 嬌1，2，趙 敏1，楊 穎1，李 慶1，黃俊明1，*，楊杏芬1，*
（1. 廣 東省疾病預防控制中心衛(wèi)生毒理所，廣東 廣州 511430；2. 廣 東省生物制品與藥物研究所藥理研究室，廣東 廣州 510440）

【摘要】目的： 探討三七的急性毒性和致突變性，為評價其安全性提供毒理學依據(jù)。方法：采用小鼠急性經(jīng)口毒性試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗和Ames試驗，參考《食品安全性毒理學評價程序》進行。小鼠急性經(jīng)口毒性試驗采用最大耐受劑量法，折合劑量為15 g/kg。小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗及小鼠精子畸形試驗均設10.00、5.00、2.50 g/kg劑量組，另設溶劑和陽性對照組。Ames試驗設2、8、40、200、1 000、5 000 μg/皿劑量組，另設自發(fā)回變組、溶劑及陽性對照組。結(jié)果：急性毒性試驗顯示小鼠對三七經(jīng)口灌胃的最大耐受劑量>15 g/kg。小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗和精子畸形試驗中，各劑量組的微核率和精子畸形率與溶劑對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Ames試驗中，在加與不加S9時各劑量組回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，亦無劑量-反應關(guān)系，結(jié)果為陰性。結(jié)論：在本實驗條件下，三七對小鼠的經(jīng)口急性毒性屬于無毒級，對小鼠體細胞、雄性生殖細胞和鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株均未見潛在的致突變性。

【關(guān)鍵詞】三七；急性毒性；致突變性；微核試驗；精子畸形試驗；Ames試驗

作者信息： 唐 嬌，E-mail：tangjiao85@163.com。*通信作者，黃俊明，E-mail：huangjunming@cdcp.org.cn；楊杏芬，E-mail：yangxingfen

Study on acute toxicity and mutagenicity of Panaxnotoginseng

TANG Jiao1，2，ZHAO Min1，YANG Ying1，LI Qing1，HUANG Junming1，*，YANG Xingfen1，*
(1. Institute of Toxicology, Guangdong Provincial Center for Disease Control and Prevention, Guangzhou 511430; 2. Department of Pharmacology, Guangdong Provincial Institute of Biological Products and Materia Medica, Guangzhou 510440, Guangdong, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To access the safety of Panaxnotoginseng as a health food through assessing its acute toxicity and mutagenicity. METHODS：Oral acute toxicity test，mouse bone marrow micronucleus test，mouse sperm malformation test，Ames test were performed according to the national standard procedures for toxicological assessment of foods. RESULTS：The MTD of Panaxnotoginseng in mouse was more than 15 g/kg，the polychromatic eryrocyte micronucleus rates，sperm abnormality rates at all doses (10.00，5.00，2.50 g/kg) were not significantly different from the solvent control. In the presence or absence of S9 or not，the number of revertant colonies in six dose groups (2，8，40，200，1 000，5 000 μg/plate) did not exceed 2- fold of the spontaneous revertant colony number，nor was there a dose-response relationship，the results of Ames test was negative. CONCLUSION：Panaxnotoginseng did not show acute toxicity and mutagenicity u nder our study conditions.

【KEY WORDS】Panaxnotoginseng；acute toxicity；mutagenicity；micronucleus test；mouse sperm malformation test；Ames test

三七為五加科植物三七的干燥根，主產(chǎn)于云南、廣西等地，多數(shù)情況為磨粉直接食用[1]。三七含有人參皂苷、三七皂苷及多糖等活性成份[2]。藥理分析表明，其具有降血脂[3]，鎮(zhèn)靜安神、調(diào)節(jié)機體免疫功能[4-5]，緩解動脈粥樣硬化[6]，抗腫瘤[7]等多種功能。由于三七的上述作用，三七不但用于臨床治療，還廣泛應用于食療藥膳中，具有提高人體免疫力，增強體質(zhì)，延緩衰老的作用[8]。近幾年，隨著食品藥品加工技術(shù)的進步，三七應用于具有安神助眠、提高免疫力、降低血脂等功能的保健產(chǎn)品的開發(fā)。但是，鮮見三七作為保健食品長期服用方式的安全性評價。本文對三七的經(jīng)口急性毒性和致突變性進行研究，完善其安全性評價基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試物 采用產(chǎn)自云南文山州的三七作為試驗材料，購于廣州健安堂藥業(yè)有限公司。機械粉碎成粉末，過120目網(wǎng)篩供試驗用。經(jīng)中國廣州分析測試中心檢測其中三七皂苷R1的含量為1.92%。因其不溶于水，以羧甲基纖維素鈉將其配成混懸液進行實驗。

1.1.2 實驗動物及實驗條件 采用廣東省實驗動物中心提供的NIH種SPF級健康小白鼠，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2008-0002。動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動物房，動物使用許可證號SYXK(粵)2008-0011，室溫20～26℃，濕度40%～70%。

1.1.3 菌種及S9混合液 鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102試驗菌株，經(jīng)過生物學鑒定符合要求。大鼠肝S9混合液由廣東省疾病預防控制中心毒理所提供。

1.1.4 主要試劑 疊氮鈉、敵克松、1，8-二羥蒽醌，羧甲基纖維素、Giemsa染料均購自Sigma公司；2-乙酰胺基芴購自Fluka公司，絲裂霉素-C購自Roche公司，生物素購自上海源聚生物科技有限公司，組氨酸由中國科學院上海生物化學研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 小鼠急性毒性試驗[9]采用最大耐受量法。選用體質(zhì)量18～22 g的健康NIH種小白鼠20只，雌雄各半，觀察3 d后，禁食16 h，不限制飲水。試驗時，用羧甲基纖維素配置受試物濃度為0.25 g/mL，充分混勻后按20 mL/kg灌胃，24 h內(nèi)灌胃3次，每次間隔4 h 以上，累計劑量15 g/kg。灌胃后立即觀察小鼠有無異常表現(xiàn)及程度、出現(xiàn)時間、死亡情況等。連續(xù)觀察14 d 。

1.2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗[10]采用30 h給受試物法進行試驗。選擇NIH種小鼠50只，體質(zhì)量25~30 g，隨機分為5組即3個受試物劑量組、溶劑對照及陽性對照組，每組10只，雌雄各半。根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果，設受試物為10.00、5.00、2.50 g/kg共3個劑量組，溶劑對照組給予等量羧甲基纖維素，陽性對照組選用40 mg/kg環(huán)磷酰胺。灌胃量均為20 mL/kg，24 h后以同樣的劑量進行第2次染毒，6 h后，處死小鼠取胸骨骨髓制片、染色、油鏡下每只小鼠觀察1 000個嗜多染紅細胞(polychromatic erythrocyte，PCE)，計數(shù)含有微核的嗜多染紅細胞數(shù)，計算各組微核發(fā)生率(‰)，同時計數(shù)200個PCE時觀察到的正染紅細胞(normochromatic erythrocyte，NCE)，計算嗜多染紅細胞數(shù)與成熟紅細胞數(shù)比值(nPCE/nRBC)。

1.2.3 精子畸形試驗[11]選擇NIH種雄性小鼠25只，體質(zhì)量25～35 g，隨機分成5組(同微核試驗)，每組5只。每天灌胃1次，連續(xù)灌胃5 d，灌胃量均為20 mL/kg，首次染毒后第35天處死動物取雙側(cè)附睪按常規(guī)制備精子涂片，染色，高倍鏡下每只小鼠觀察1 000個完整精子，計數(shù)含有精子畸形的數(shù)量和類型，計算各組精子畸形發(fā)生率(‰)。

1.2.4 Ames試驗[12]TA97、TA98、TA100、TA102標準菌株，采用常規(guī)平板摻入法。設三七粉2、8、40、200、1 000、5 000 μg/皿共6個劑量組，同時設陽性對照組、羧甲基纖維素溶劑對照組及各菌株的自發(fā)回變組。在加S9和不加S9兩種情況下，每個菌株每個劑量均設3個平行皿，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)每皿回變菌落數(shù)，計算各組平均菌落數(shù)。實驗重復2次。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0對微核率、精子畸形率進行χ2檢驗。Ames試驗中的菌落數(shù)采用-x±s的方式表示，進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠急性毒性試驗

在14 d觀察期內(nèi)，雌、雄小鼠外觀均正常，四肢活動正常，無死亡。剖檢未出現(xiàn)肉眼可見病變。獲得雌雄小鼠三七經(jīng)口急性毒性最大耐受劑量(maximum tolerated dose，MTD)>15 g/kg。根據(jù)急性毒性分級標準，將其判定為無毒級物質(zhì)。

2.2 三七對小鼠骨髓細胞微核率的影響

小鼠骨髓細胞微核試驗的結(jié)果見表1，可見各劑量組的PCE微核率與溶劑對照組比較，經(jīng)χ2檢驗差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，試驗結(jié)果為陰性；而環(huán)磷酰胺陽性對照組的PCE微核率明顯高于陰性對照組(P<0.01)。各劑量組nPCE/nRBC均 在正常值范圍內(nèi)(不能少于陰性對照組的20%)。

2.3 三七對小鼠精子畸形率的影響

小鼠精子畸形試驗的結(jié)果見表2，各劑量組小鼠的精子畸形率與溶劑對照組比較，經(jīng)χ2檢驗差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，試驗結(jié)果為陰性；而環(huán)磷酰胺陽性對照組的精子畸形率明顯高于陰性對照組(P<0.01)。

2.4 Ames試驗結(jié)果

Ames試驗回變菌落數(shù)統(tǒng)計結(jié)果見表3，鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102共4株試驗菌株，在加及不加S9時，5 000、1 000、200、40、8、2 μg/皿5個三七劑量組回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，亦無劑量-反應關(guān)系，無致突變性。在本實驗條件下，各陽性對照組均顯示出強烈的誘變作用，而各組自發(fā)回變數(shù)均在正常范圍內(nèi)，表明該試驗系統(tǒng)可靠。第2次結(jié)果與第1次相同，未重復列出。

表1 小鼠骨髓細胞微核試驗結(jié)果

表2 小鼠精子畸形率統(tǒng)計(n=5)

表3 Ames試驗回變菌落數(shù)統(tǒng)計結(jié)果

3 討 論

目前，三七廣泛用于日常藥膳及保健食品的開發(fā)，然而其保健用途的安全性還缺乏科學的評估資料。本試驗根據(jù)國家標準《食品安全性毒理學評價程序》，考慮體內(nèi)與體外試驗，體細胞試驗與生殖細胞試驗相結(jié)合的原則，選用了小鼠急性毒性試驗、Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗相結(jié)合，綜合評價三七的致突變性。

小鼠急性毒性試驗MTD>15 g/kg，三七屬于無毒級。Ames試驗結(jié)果為陰性，表明三七在體外試驗中未發(fā)現(xiàn)致突變作用。體內(nèi)試驗中的小鼠骨髓細胞微核試驗結(jié)果表明在本實驗劑量范圍內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)三七對體細胞的致突變作用，小鼠精子畸形試驗亦未發(fā)現(xiàn)三七對生殖細胞的致突變作用。

在以往的相關(guān)研究中，鮮三七液的急性毒性試驗的毒性劑量分級標準為無毒級；設定劑量1、2、5 g/kg分別為低、中、高劑量組進行小鼠骨髓細胞染色體畸變試驗和小鼠睪丸生殖細胞染色體畸變試驗，染色體畸變率各實驗組和對照組之間無顯著性差異，未見致突變性[13]。本實驗相對以往的研究，選用三七粉為受試物，是人們在日常保健中最常食用的受試物狀態(tài)，不同于鮮三七液為提取液。并且試驗最高劑量提高到10.00 g/kg，拓寬了三七的安全范圍。

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收稿日期：2015-06-16；

修訂日期：2015-11-18

中圖分類號：Q394.6

文獻標志碼：A

文章編號：1004-616X(2016)01-0066-04

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.014