陳　聰，廖　菁，李　鑫，宋厚盼，黃政德*（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208）

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加味丹參飲抑制p38MAPK表達(dá)保護(hù)缺氧/復(fù)氧乳鼠心肌細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究

陳聰，廖菁，李鑫，宋厚盼，黃政德*
（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208）

〔摘要〕目的觀察加味丹參飲含藥血清對缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）乳鼠心肌細(xì)胞p38 MAPK蛋白表達(dá)的影響，以探討其保護(hù)心肌的作用機(jī)制。方法將20只SD乳鼠的心肌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，建立H/R模型并隨機(jī)分為H/R組、SB203580（p38MAPK阻斷劑組）、加味丹參飲含藥血清組，正常心肌細(xì)胞組作為對照組。采用T淋巴細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定心肌細(xì)胞，羅丹明B（Rhodamine B）染色法觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT比色法檢測含藥血清對乳鼠心肌細(xì)胞的毒性，Western-blot法檢測MKK3（促分裂原活化蛋白激酶-激酶3）、MKK6（促分裂原活化蛋白激酶-激酶6）、p38MAPK、phospho-p38MAPK蛋白表達(dá)。結(jié)果與正常血清對照組比較，H/R組MKK3、MKK6的蛋白表達(dá)增多，p38MAPK通路阻斷劑SB203580和加味丹參飲均不能減少其表達(dá)；p38MAPK、phospho-p38MAPK在H/R時(shí)表達(dá)均增加（P＜0.01），而SB203580和加味丹參飲含藥血清均能減少其表達(dá)（P＜0.01）。結(jié)論加味丹參飲含藥血清預(yù)處理可通過抑制缺氧，復(fù)氧心肌細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用，抑制p38MAPK表達(dá)及其磷酸化，減輕心肌細(xì)胞損傷，起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

〔關(guān)鍵詞〕加味丹參飲；心肌細(xì)胞；缺氧/復(fù)氧；p38MAPK信號(hào)通路；促分裂原活化蛋白激酶-激酶3；促分裂原活化蛋白激酶-激酶6；丹參；檀香；赤芍

Experimental Study of Modified Jiawei Danshen Decoction on the Protection of Hypoxia/Reoxygenation Myocardial Cells Injury by Inhibition of p38MARK Expression in Neonatal Rats

CHEN Cong, LIAO Jing, LI Xin, SONG Houpan, HUANG Zhengde*
（Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China）

〔Abstract〕Objective To observe the protective effect of modified Danshen Decoction containing serum on p38MARK expression in myocardial cells of hypoxia/reoxygenation（H/R）neonatal rats and ivvestigate its underlying molecular mechanisms. Methods Cardiomyocytes from 20 neonatal SD rats were primary cultured, and the built H/R models were randomly divided into H/R group, SB203580 group（p38MAPK inhibitor group）, modified Danshen Decoction-containing serum group, and the normal cultured cardiomyocytes were as the control group. Cardiomyocytes were identified by T cell chemical staining method, and the morphologic changes in cardiomyocytes were observed by the Rhodamine B staining. Cytotoxicity of drug-contained sera was determined by the MTT method. Expression of MAP Kinase Kinase 3（MKK3）, MKK6, p38MAPK, and phospho-p38MAPK were measured by the Western blotting. Results Compared with the normal serum control group, the expressions of MKK3 and MKK6 were increased in H/R group, which was not altered by SB203580 and modified Danshen Decoction; The levels of p38MAPK and phospho -p38MAPK at H/R were increased, while the p38MAPK and phosphop -38MAPK expression in SB203580 and modified Danshen Decoction groups were decreased. Conclusion The modified Danshen Decoction could protectcardiomyocytes and decrease H/R -induced myocardial cells injury by inhibiting the expression and phosphorylation of p38MAPK through the inhibition of its p38MAPK signaling pathway .

〔Keywords〕modified Danshen Decocotion; cardiomyocytes; hypoxia/reoxygenation；p38MAPK signaling pathway；MAP Kinase Kinase 3; MAP Kinase Kinase 6; Salvia miltiorrhiza; sandalwood; red peony root

心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion, IR）損傷是目前心血管疾病研究的熱點(diǎn)，新近研究顯示了中醫(yī)藥預(yù)處理對心肌IR損傷保護(hù)的優(yōu)勢[1]。p38絲裂原激活的蛋白激酶（p38MAPK）信號(hào)通路是1993年發(fā)現(xiàn)的一類MAPK信號(hào)通路，它通過轉(zhuǎn)錄因子磷酸化而改變基因的表達(dá)水平，參與多種胞內(nèi)信息傳遞過程，被認(rèn)為是細(xì)胞眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中轉(zhuǎn)站。在心肌IR時(shí)由于氧自由基和細(xì)胞因子的大量釋放而激活p38MAPK，p38MAPK把信息傳到核內(nèi)，引起一些早期基因的表達(dá)[2-3]。

加味丹參飲是從《時(shí)方歌括》中的丹參飲去砂仁，加川芎、當(dāng)歸等化裁而成，課題組前期臨床與實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，采用加味丹參飲治療心肌IR損傷能取得滿意的療效[4-5]。加味丹參飲對冠心病有較好降脂作用，對家兔食餌性動(dòng)脈粥樣硬化具有顯著的防治作用，對IR損傷心肌有保護(hù)作用。本研究通過觀察加味丹參飲含藥血清對缺氧/復(fù)氧（H/R）乳鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及p38MAPK蛋白表達(dá)影響研究，旨在為加味丹參飲治療心肌細(xì)胞IR損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料

1.1動(dòng)物

選用20只12 h～1 d齡SD乳鼠，雌雄不拘；20只清潔級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量200～250 g，均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2009-0004。

1.2藥物

加味丹參飲（丹參20 g，檀香6 g，赤芍10 g，川芎6 g，當(dāng)歸6 g，紅花6 g，生地黃12 g）飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)水煎濃縮至含生藥量為2 g/mL。

1.3試劑

SB203580（p38MAPK抑制劑）（碧云天生物技術(shù)研究所），促分裂原活化蛋白激酶-激酶3 （MKK3）、促分裂原活化蛋白激酶-激酶6（MKK6）、p38MAPK、phospho-p38MAPK兔抗小鼠一抗（美國CST公司），HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（美國KPL公司），RNAiso Plus reagent、PrimeScriptTMRT Master Mix、SYBR Premix Ex TaqTM II（日本Takara生物公司）。

1.4儀器設(shè)備

M2300二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Sheldon公司），IX-71型倒置顯微鏡（日本Olympus公司），PowerPac Universal電泳儀、Mini-Sub Cell GT水平電泳槽、ChemiDocTM XRS＋成像儀（美國Bio-Rad公司）。

2　方法

2.1加味丹參飲含藥血清制備

將20只SD成年大鼠隨機(jī)分為正常血清對照組和藥物血清組，分別制備正常血清和藥物血清。藥物血清組以6.42 g/kg加味丹參飲灌胃，正常血清對照組以等量生理鹽水灌胃，均為每日2次，連續(xù)3 d。于末次給藥1 h后在無菌條件下進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，分離血清；56℃、30 min滅活補(bǔ)體后，采用0.22 μm微孔濾膜濾過除菌，分裝，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)

無菌條件下，開胸取出SD乳鼠心臟，棄除與心臟相連大血管和心房組織，于4℃PBS緩沖液中漂洗3次。接著采用眼科剪將心室組織剪成0.5～1 mm3碎塊，加入1 mL0.08%胰酶于37℃恒溫水浴箱中消化5 min，棄除全部上清液。接著在沉淀中加入1 mL混合酶（0.06%胰酶＋0.08% I型膠原酶）振蕩消化5 min，靜置后將上清液移入離心管，用含15%特級(jí)胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液中止消化。重復(fù)以上消化步驟3次，收集各次上清液，經(jīng)200目篩網(wǎng)濾過，850 r/min離心10 min。棄去上清液，用含15%特級(jí)胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液吹散沉淀細(xì)胞，采用差速貼壁法棄除成纖維細(xì)胞。將未貼壁的心肌細(xì)胞濃度調(diào)整至5×105/mL，接種于6孔板，每孔添加2.5 mL培養(yǎng)液。另以1×104個(gè)/孔接種于96孔板內(nèi)，每孔加入200 μL培養(yǎng)液，以進(jìn)行MTT（噻唑藍(lán)）檢測。用培養(yǎng)液將藥物血清調(diào)配成原濃度的5%、10%、15%、20%、25%、30%六個(gè)濃度，用于檢測藥物血清細(xì)胞毒性并確定最佳給藥濃度。

2.3心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的建立及分組處理

參考文獻(xiàn)[6]方法將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞分別予以不同預(yù)處理，培養(yǎng)30 min。接著配制不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，加入雙抗（青霉素＋鏈霉素）。用無菌N2（流速為1 L/min）將培養(yǎng)基充分飽和30 min，使溶液氧分壓從20 KPa降至4 KPa。迅速將該飽和后的培養(yǎng)基置換六孔板內(nèi)的原培養(yǎng)基，并將六孔板置入消毒的塑料袋，通入高純度N2，于37℃密封。3 h后將含飽和N2培養(yǎng)液換為正常培養(yǎng)液，置入充滿醫(yī)用氧氣的消毒塑料袋內(nèi)，37℃密閉，復(fù)氧2 h，收集上清液。正常血清對照組在完全培養(yǎng)基中加入與含藥血清同工作濃度的大鼠正常血清，連續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h；H/R組為先缺氧3 h，后復(fù)氧2 h；SB203580組在培養(yǎng)液中加入p38MAPK SB203580（終濃度為10 μmol/L）；加味丹參飲含藥血清組則在培養(yǎng)液中加入相應(yīng)濃度的加味丹參飲含藥血清。

2.4檢測項(xiàng)目及指標(biāo)測定

2.4.1心肌細(xì)胞鑒定與形態(tài)學(xué)觀察采用心肌特異性肌鈣蛋白T（cTnT）免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對心肌細(xì)胞進(jìn)行處理，通過倒置顯微鏡觀察鑒定心肌細(xì)胞。缺氧處理后，采用羅丹明B（Rhodamine B）染色。

2.4.2MTT比色法檢測含藥血清對乳鼠心肌細(xì)胞的細(xì)胞毒性乳鼠心肌細(xì)胞給藥預(yù)處理后，每孔繼續(xù)加入22.2 μL 5 mg/mL的MTT溶液，吹打混勻，于37℃恒溫孵育4 h，接著吸棄含MTT的培養(yǎng)液，每孔加入150 μLDMSO通過酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm處的吸光度（OD值）。

2.4.3Western-blot法檢測MKK3、MKK6、p38MAPK、磷酸化p38MAPK蛋白的表達(dá)乳鼠心肌細(xì)胞給予受試藥后，采用RIPA裂解液提取心肌細(xì)胞總蛋白，BCA法對蛋白進(jìn)行定量，制備Western Blot上樣樣品，接著進(jìn)行SDS-PAGE電泳。停止電泳后，將海綿墊、濾紙、凝膠、PVDF膜組成的“三明治”結(jié)構(gòu)放置于轉(zhuǎn)膜液中恒流200 mA轉(zhuǎn)膜90 min。接著將PVDF膜置于含5%BSA的TBST中封閉1 h，洗膜3次后分別用小鼠來源β-actin、MKK6、p38MAPK、 phospho-p38MAPK一抗和兔來源MKK3一抗4℃孵育過夜，洗膜3次后加入相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，加入ECL發(fā)光液反應(yīng)5 min后，在ChemiDoc XR＋成像儀中觀察蛋白條帶表達(dá)情況，并用儀器自帶的Image Lab軟件統(tǒng)計(jì)分析各組蛋白條帶的光密度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取光密度平均值。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料數(shù)據(jù)均用“±s”表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者采用LSD法，方差不齊者用Dunnett’s T3法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果與分析

3.1心肌細(xì)胞的鑒定及最佳加味丹參飲含藥血清測定

倒置顯微鏡下觀察貼壁的心肌細(xì)胞呈多角形，大小較均勻，含1～2個(gè)細(xì)胞核，單個(gè)細(xì)胞可見自發(fā)性搏動(dòng)。H/R后的心肌細(xì)胞形態(tài)較為皺縮，自發(fā)性搏動(dòng)的心肌細(xì)胞數(shù)目減少，搏動(dòng)頻率減慢，搏動(dòng)幅度變小，同步化搏動(dòng)幾乎消失。采用cTnT免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對上清液進(jìn)行檢測，確定為心肌細(xì)胞。經(jīng)MTT法檢測確定10%濃度的加味丹參飲含藥血清為最佳工作濃度（圖1）。

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。圖1　加味丹參飲含藥血清最佳工作濃度篩選柱形圖

3.2加味丹參飲對H/R心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響

正常心肌細(xì)胞呈圓形、梭形、菱形或多角形，細(xì)胞逐漸在皿底鋪展，伸出偽足，形成不規(guī)則的星形并相互接觸交織成網(wǎng)，無碎片；H/R組細(xì)胞形態(tài)極不規(guī)則，可見大量細(xì)胞碎片；SB203580組心肌細(xì)胞形狀較規(guī)則，碎片較多；10%加味丹參飲含藥血清預(yù)處理后，心肌細(xì)胞形狀較規(guī)則，碎片明顯減少。見圖2。

注：A.正常血清對照組，B.H/R組，C.SB203580組，D：加味丹參飲含藥血清組圖2　H/R心肌細(xì)胞形態(tài)倒置顯微鏡觀察圖（Rhodamine B染色，×400）。

3.3加味丹參飲對H/R心肌細(xì)胞MKK3、MKK6、p38MAPK、phospho-p38MAPK蛋白表達(dá)的影響

與正常血清對照組比較，H/R組乳鼠心肌細(xì)胞的MKK3、MKK6、p38MAPK、phospho -p38MAPK蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.01）；與H/R組比較，SB203580組及加味丹參飲含藥血清組乳鼠心肌細(xì)胞的MKK3、MKK6蛋白表達(dá)均無明顯變化（P＞0.05），而p38MAPK、phospho-p38MAPK蛋白表達(dá)均明顯減少（P＜0.01）；與SB203580組比較，加味丹參飲含藥血清組乳鼠心肌細(xì)胞的MKK3、MKK6、p38MAPK、phospho-p38MAPK蛋白表達(dá)均無明顯變化（P＞0.05）。以上結(jié)果提示，H/R時(shí)MKK3、MKK6的蛋白表達(dá)增多，而p38MAPK通路阻斷劑SB203580和加味丹參飲均不能減少其表達(dá)；p38MAPK、phospho-p38MAPK在H/R時(shí)表達(dá)亦均增加，但SB 203580和加味丹參飲含藥血清均能減少其表達(dá)。見圖3。

注：1.正常血清對照組，2.H/R組，3.SB 203580組，4.加味丹參飲含藥血清組。與正常血清對照組比較＃（P＜0.01），與H/R組比較*（P＜0.01）。圖3　加味丹參飲含藥血清對H/R心肌細(xì)胞MKK3、MKK6、p38MAPK、phospho-p38MAPK蛋白表達(dá)影響（上為電泳圖，下為柱狀圖）

4　討論

大量研究表明，心肌IR可導(dǎo)致心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、功能、代謝及電生理方面發(fā)生進(jìn)一步損傷[7]。減輕和消除心肌IR造成的心肌組織損傷是心血管研究領(lǐng)域亟待解決的重大科學(xué)問題，引起了國內(nèi)外研究者的高度關(guān)注。有研究表明，p38MAPK信號(hào)通路的激活在心肌IR的病理生理進(jìn)程中具有重要作用[2-3,8-9]。研究認(rèn)為，心肌IR時(shí)，細(xì)胞因子和氧自由基的大量釋放，促進(jìn)p38MAPK信號(hào)通路的特異性激活物MKK3、MKK6的磷酸化，進(jìn)而激活p38MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)多核白細(xì)胞、黏附分子和細(xì)胞活化素等在心肌再灌注區(qū)域聚集，從而加劇炎性反應(yīng)，造成心肌損傷[8-10]。因此，抑制p38MAPK信號(hào)通路的活化可能是治療心肌IR的重要靶標(biāo)。

新近研究顯示，中醫(yī)藥預(yù)處理能有效保護(hù)心肌IR損傷[11-12]。課題組前期研究顯示，無論是臨床研究，抑或是實(shí)驗(yàn)研究，加味丹參飲均對心肌IR損傷具有良好的保護(hù)作用[5,12-15]。本課題組采用心肌細(xì)胞H/R損傷模型以模擬心肌IR損傷模型，對加味丹參飲保護(hù)心肌IR損傷的作用機(jī)制進(jìn)行詳盡的探討。研究結(jié)果顯示，加味丹參飲對乳鼠心肌細(xì)胞p38MAPK及phospho-p38MAPK蛋白均有較好的抑制作用，而對上游MKK3、MKK6蛋白表達(dá)無影響。研究提示，加味丹參飲可能是直接作用于p38MAPK 和phospho-p38MAPK蛋白而發(fā)揮其保護(hù)心肌IR損傷作用。

綜上所述，加味丹參飲預(yù)處理對心肌IR損傷具有良好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制p38MAPK信號(hào)通路的活化，進(jìn)而抑制多核白細(xì)胞、黏附分子和細(xì)胞活化素等炎性細(xì)胞在心肌再灌注區(qū)域聚集有關(guān)。

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（本文編輯楊瑛）

〔通訊作者〕*黃政德，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：Hzd112@163.com。

〔作者簡介〕陳聰，女，碩士，講師，研究方向：中醫(yī)內(nèi)科學(xué)心血管疾病。

〔基金項(xiàng)目〕國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81373576）；湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃課題（B0347）；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（14C0872）；湖南省科技廳科學(xué)研究項(xiàng)目（2014SK3034）；湖南省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)課題（201304）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀教師培養(yǎng)計(jì)劃（2015）。

〔收稿日期〕2015-09-08

〔中圖分類號(hào)〕R285.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.02.010