秦　漢，胡志希*，李　琳，呂　佳，楊　楊，張　易（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208）

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雪蓮?fù)}丸對冠心病氣虛血瘀證小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)指標(biāo)ET-1、NO、ACE的影響

秦漢，胡志希*，李琳，呂佳，楊楊，張易
（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208）

〔摘要〕目的觀察雪蓮?fù)}丸對冠心病氣虛血瘀證小鼠內(nèi)皮素-1（ET-1）、一氧化氮（NO）和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）的調(diào)節(jié)作用。方法建立冠心病氣虛血瘀證小鼠模型，隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、地奧心血康組和雪蓮?fù)}丸組。給藥4周后取小鼠血清，ELISA試劑盒測定ET-1、NO和ACE濃度。結(jié)果與模型組比較，雪蓮?fù)}丸組NO濃度顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ET-1濃度降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ACE濃度顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與地奧心血康組比較，雪蓮?fù)}丸組NO濃度顯著升高，ACE濃度顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論冠心病氣虛血瘀證的發(fā)生可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能指標(biāo)具有相關(guān)性。其中，冠心病氣虛血瘀證可能與血清ET-1、ACE濃度呈正相關(guān)、與血清NO濃度呈負(fù)相關(guān)。雪蓮?fù)}丸對冠心病氣虛血瘀證小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能指標(biāo)具有調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能與升高血清NO濃度、降低ET-1、ACE濃度有關(guān)，且與地奧心血康組比較在改善血清NO、ACE方面具有一定優(yōu)勢。

〔關(guān)鍵詞〕雪蓮?fù)}丸；氣虛血瘀證；冠心?。粌?nèi)皮素-1；一氧化氮；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶；天山雪蓮；西洋參；肉蓯蓉

Effects of Xuelian Tongmai Pill on Vascular Endothelial Cell Function-Related Marker ET-1, NO and ACE in Coronary Heart Disease Mice Models with Qi Deficiency and Blood Stasis Syndrome

QIN Han, HU Zhixi*, LI Lin, LV Jia, YANG Yang, ZHANG Yi
（Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China）

〔Abstract〕Objective To observe the regulatory effects of Xuelian Tongmai Pill（XTP）on endothelin-1（ET-1）, nitric oxide（NO）and angiotensin converting enzyme（ACE）in coronary heart disease mice models with Qi deficiency and blood stasis syndrome. Methods Coronary heart disease mice models with Qi deficiency and blood stasis syndrome were established and then distributed to blank control group, model control group, Di'ao Xinxuekang group and XTP group. Serum of each group were picked after four weeks. The concentration of ET-1, NO and ACE were measured by ELISA. Results Compared with model group, concentration of NO was highly elevated with statistical significance（P＜0.01）; ET -1 was decreased with statistical significance（P＜0.05）; ACE was prominently decreased with statistical significance（P＜0.01）. Compared with Di'ao Xinxuekang group, the concentration of NO was highly increased, while ACE was significantly decreased, the diffrences have statistical significance（P＜0.01）. Conclusion Morbidity of coronary disease with Qi deficiency and blood stasis syndrome may be related to the indicators of vascular endothelial cell function. Qi deficiency and blood stasis syndrome Serum concentration of showed positive relations with ET-1 and ACE, while negative relation with NO concentration. XTP showed regulatory function on the indicator of vascular endothelial cell function. The mechanism may be related to the increasing of serum concentration of NO and decreasing of ET-1 and ACE. In addition, XTP showed more advantages inimproving serum NO and ACE concentration.

〔Keywords〕Xuelian Tongmai Pill; Qi deficiency and blood stasis syndrome; coronary heart disease; endothelin-1; nitric oxide; angiotensin converting enzyme；Saussurea involucrate; American ginseng; Cistanche salsa

冠心病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病，其發(fā)病率、病死率、住院率呈迅速上升趨勢[1]。冠心病始于冠狀動脈粥樣硬化，繼而產(chǎn)生管腔狹窄或閉塞，導(dǎo)致心肌缺血缺氧。研究證實(shí)：氣虛血瘀型冠心病存在血管內(nèi)皮功能異常，并貫穿其發(fā)生發(fā)展過程的始終[2]。內(nèi)皮素-1（ET-1）和一氧化氮（NO）是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的一對具有拮抗效應(yīng)的活性物質(zhì)，是反映血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的常用指標(biāo)。兩者的比例失衡加劇了冠心病的病情發(fā)展。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）活性的異常增強(qiáng)，使其產(chǎn)物血管緊張素II （AngII）水平升高，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、冠狀動脈痙攣等病理過程的發(fā)生。

雪蓮?fù)}丸系名老中醫(yī)驗(yàn)方，由天山雪蓮等20余味中草藥組成，臨床應(yīng)用多年，可改善心肌供血狀態(tài)[3]。本研究從病證結(jié)合的角度入手，通過觀察雪蓮?fù)}丸對冠心病氣虛血瘀證小鼠血清ET-1、NO 和ACE水平的干預(yù)作用，探究其防治冠心病的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)佐證。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1受試藥物雪蓮?fù)}丸由天山雪蓮、西洋參、首烏、槐米、牛膝等20余味中草藥組成，由烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院及國藥集團(tuán)新疆制藥有限公司聯(lián)合配制而成。批號：140112，規(guī)格：每丸重約0.2 g、60 g/瓶，用時(shí)以蒸餾水溶散為質(zhì)量分?jǐn)?shù)200 mg/mL的懸濁液；地奧心血康膠囊，成都地奧制藥集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，批號：1407011，規(guī)格：每粒含地奧心血康100 mg、20粒/盒，用時(shí)以蒸餾水配制成6 mg/mL的懸濁液。

1.1.2動物昆明小鼠60只，雄性，5～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，SPF級，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2013-0004。

1.1.3主要試劑、儀器NO試劑盒，南京建成生物工程研究所提供，批號：20141230。ET-1、ACE試劑盒，武漢華美生物工程有限公司提供，批號：G05031688，E24031686。KDC-2044低速冷凍離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1造模第一階段（氣虛血瘀證模型）參照文獻(xiàn)[4-6]，采用“游泳＋饑餓＋高脂飲食”的復(fù)合方法誘導(dǎo)小鼠氣虛血瘀證模型。空白對照組給予正常飲食，模型對照組和2個(gè)治療組運(yùn)用游泳法使小鼠達(dá)到力竭狀態(tài)，給予饑餓喂養(yǎng)，食量為正常小鼠每日攝食量的60%，飼料為高脂飼料，造模周期為6周。

1.2.2造模第二階段（心肌缺血模型）氣虛血瘀證造模周期結(jié)束后，進(jìn)行心肌缺血模型的復(fù)制[7]。3個(gè)造模組按20單位/kg劑量腹腔注射垂體后葉素，空白對照組注射等體積的蒸餾水，每日注射一次。2周后，從四組中分別隨機(jī)抓取小鼠，烏拉坦1 μg/g麻醉后用心電圖機(jī)記錄小鼠的心電圖，通過軟件記錄數(shù)據(jù)，觀察心率和T波高度變化來判斷心肌缺血造模是否成功。

1.2.3驗(yàn)證模型（1）行為學(xué)特征：造模組小鼠表現(xiàn)出倦怠少動，活動無力，毛發(fā)枯槁、稀疏脫落等。對照組小鼠則活動自如，毛色潔白光澤，未見其他異常表現(xiàn)；（2）血液流變學(xué)：造模組小鼠高、中、低切變率的全血粘度均顯著高于或低于對照組，造模組的血漿粘度高于對照組；（3）心肌缺血模型驗(yàn)證：造模組小鼠心率增快，心電圖示T波低平或倒置。綜上所述，以心電圖的表現(xiàn)定位在心，血液流變學(xué)指標(biāo)的改變定性為血瘀，結(jié)合行為特征的改變定性為氣虛，則冠心病氣虛血瘀證小鼠模型復(fù)制成功。

1.2.4動物分組60只小鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)抽取15只作為空白對照組，對其余45只小鼠進(jìn)行冠心病氣虛血瘀證模型的制作。造模成功后，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為模型對照組、地奧心血康組和雪蓮?fù)}丸組。

1.2.5給藥方法小鼠每日在同一時(shí)間段以藥液或蒸餾水灌胃，給藥劑量按人鼠體表面積折算法計(jì)算[8]。雪蓮?fù)}丸組按2.7 g/（kg·d）劑量灌胃，地奧心血康組按0.09 g/（kg·d）劑量灌胃，模型組和空白對照組小鼠予蒸餾水灌胃，均為1次/d，連續(xù)給藥4周。

1.3指標(biāo)檢測給藥4周后，立即行小鼠眶周靜脈取血，血液不經(jīng)任何處理，于室溫放置。低溫下3 000 r/min離心15 min，取上層血清檢測ET-1、NO和ACE含量。NO測定采用硝酸還原酶法，ET-1、ACE測定均采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA法），操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

這時(shí)候，我讓孩子們說說自己的感受。丁昱心說：“我心里感覺輕松了不少?！倍栒f：“我以為我的氣球會爆掉，結(jié)果比想象中的還小?！?/p>

2　結(jié)果

2.1動物存亡情況

按照造模方法“1.2.1”“1.2.2”，截止至第8周，死亡8只，死亡率18%，造模小鼠達(dá)到冠心病氣虛血瘀證模型標(biāo)準(zhǔn)的共27只，造模成功率73%。將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組、地奧心血康組和雪蓮?fù)}丸組，共3組，每組9只。各組分別灌胃4周后，模型組死亡2只，地奧心血康組和雪蓮?fù)}丸組各死亡1只。

2.2冠心病氣虛血瘀證小鼠模型驗(yàn)證

2.2.1行為學(xué)特征造模8周后，與空白組比較，模型組小鼠倦怠少動，對抗性減弱，毛發(fā)稀疏脫落。

2.2.2血液流變學(xué)造模8周后，與空白組比較，模型組小鼠全血粘度（高、中、低切變率）值顯著升高（P＜0.01）；血漿粘度值升高（P＜0.05）。以上說明模型組小鼠血液呈濃、黏的異常狀態(tài)，結(jié)合行為學(xué)特征表明模型組小鼠已經(jīng)達(dá)到氣虛血瘀證的病理狀態(tài)。見表1。

表1　兩組小鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較?。ā纒,mpa/s）

表1　兩組小鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較?。ā纒,mpa/s）

注：與空白組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

血漿粘度組別　n空白組15模型組27 F值P值全血粘度高切　中切　低切4.55±0.06　6.04±0.42 18.09±1.95 9.15±0.16＃＃10.94±0.17＃＃28.00±0.28＃＃1948.39　341.17　38.97 ＜0.001?。?.001?。?.001 2.23±0.10 3.11±0.10＃197.49 ＜0.001

2.2.3心肌缺血模型造模8周后，與空白組比較，模型組小鼠心率增快（P＜0.05）、心電圖示T波高度明顯降低（P＜0.01）。說明模型組小鼠已經(jīng)達(dá)到心肌缺血的病理狀態(tài)。見表2。

表2　兩組小鼠心電圖T波高度和心率對比?。ā纒）

表2　兩組小鼠心電圖T波高度和心率對比　（±s）

注：與空白組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別　n　心率（次/min）　T波幅度（mV）空白組　15　375.38±37.74　0.278±0.089模型組　27　402.89±38.32＃　0.138±0.118＃＃F值　35.93　53.41 P值?。?.001　＜0.001

2.3各組小鼠血清血管內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)指標(biāo)ET-1、NO、ACE對比

2.3.2NO含量比較與模型組比較，雪蓮?fù)}丸組濃度顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而地奧心血康組無顯著差異（P＞0.05）。見表3。

2.3.3ACE含量比較與模型組比較，雪蓮?fù)}丸組濃度顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而地奧心血康組無顯著差異（P＞0.05）。見表3。

表3　各組血管內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)指標(biāo)ET-1、NO、ACE濃度比較?。ā纒）

表3　各組血管內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)指標(biāo)ET-1、NO、ACE濃度比較?。ā纒）

注：與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與地奧心血康組比較，**P＜0.01。

組別　n空白對照組　9模型對照組　7地奧心血康組　8雪蓮?fù)}丸組　8 F值P值ET-1（pg/mL）182.5±1.8 200.4±3.2 185.6±3.1△190.2±3.0△76.4 ＜0.001 NO（μmol/L）48.51±3.09 31.57±4.75 31.19±1.14 45.39±6.10△△** 46.70 ＜0.001 ACE（ng/mL）309.5±1.3 422.9±15.9 408.3±22.7 311.3±13.9△△** 154.6 ＜0.001

3　討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，冠心病屬“胸痹”“心痛”“真心痛”的范疇。東漢著名醫(yī)家張仲景在《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治第九》中認(rèn)為冠心病的基本病機(jī)為“陽微陰弦”，證屬本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜。研究表明：氣虛血瘀是冠心病中醫(yī)證型中較為常見的類型，氣虛是本虛中最常見的證候要素，血瘀是標(biāo)實(shí)中最常見的證候要素[9]。

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)不僅被認(rèn)為是冠狀動脈粥樣硬化的起始環(huán)節(jié)，而且與冠心病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙可用血漿標(biāo)志物來評價(jià)，其血漿標(biāo)志物的高低與冠心病病情變化相關(guān)[10]。其中，ET-1和NO是一對反映血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的常用指標(biāo)。在冠心病的領(lǐng)域中，目前的研究證實(shí)內(nèi)皮素可致冠狀動脈強(qiáng)烈痙攣，具有心肌細(xì)胞毒性作用和致心律失常作用[11-12]。故有理由認(rèn)為，內(nèi)皮素活性的異常升高對于心肌缺血甚至心肌梗塞的發(fā)生有重要意義。NO為血管舒張因子，是由L-精氨酸（L-Arg）和分子氧在NO合成酶（NOS）催化下生成的[13]。ET-1和NO兩者的比例失衡導(dǎo)致冠脈管腔變窄，加重心肌缺血缺氧，使冠心病的病情趨于惡化。腎素—血管緊張素系統(tǒng)（RAS）是冠心病發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制之一，ACE是該系統(tǒng)的重要生物活性肽，通過其產(chǎn)物AngII發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)[14]。RAS系統(tǒng)的過度激活，ACE活性增強(qiáng)，使其產(chǎn)物Ang II水平升高，充分發(fā)揮AngII的生物學(xué)效應(yīng)[15]，誘發(fā)冠脈痙攣等病理過程。因此，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能目前已成為冠心病治療研究中的一個(gè)重要靶點(diǎn)。本次研究通過復(fù)制冠心病氣虛血瘀證小鼠模型，觀察了雪蓮?fù)}丸對其血清ET-1、NO和ACE的調(diào)控作用，結(jié)果顯示：與模型組比較，雪蓮?fù)}丸組NO濃度顯著升高、ET-1濃度降低、ACE濃度顯著降低；與地奧心血康組比較，雪蓮?fù)}丸組NO濃度顯著升高、ACE濃度顯著降低。由此推測冠心病氣虛血瘀證的發(fā)生可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能狀態(tài)具有相關(guān)性。其中，冠心病氣虛血瘀證可能與血清ET-1、ACE濃度呈正相關(guān)、與血清NO濃度呈負(fù)相關(guān)。即血管內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)指標(biāo)ET-1、NO、ACE濃度的改變可能會使冠心病氣虛血瘀證的病理狀態(tài)向順或向逆發(fā)展。同時(shí)，雪蓮?fù)}丸在改善冠心病氣虛血瘀證小鼠血清ET/NO的失衡、一定程度抑制ACE的生成方面起到了作用，證明其可能通過逆轉(zhuǎn)小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、抑制冠脈收縮、改善心肌供血供氧等途徑來達(dá)到治療效果；并且較地奧心血康組在改善血清NO、ACE方面存在一定的優(yōu)勢，顯示了中醫(yī)藥辨證論治的優(yōu)勢。

心主血脈，“心氣”支配心臟發(fā)生規(guī)律性變化，從而完成心臟推動血液循環(huán)的功能，故冠心病多用活血化瘀和芳香溫通法治療。然而，單用活血化瘀藥易傷正氣，應(yīng)配合使用溫陽補(bǔ)氣的治法，能體現(xiàn)“補(bǔ)氣不壅塞，化瘀不傷正”的治療理念[16]。基于這一臨證思路，烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院根據(jù)本院名老中醫(yī)蔣賢達(dá)先生的有效驗(yàn)方研制出了雪蓮?fù)}丸這一自創(chuàng)方藥。該方由天山雪蓮、西洋參、肉蓯蓉、何首烏、槐米、紅花等20余味中草藥組成，方中西洋參大補(bǔ)元?dú)猓诪?、肉蓯蓉補(bǔ)肝腎、益精血以治本；天山雪蓮配伍川芎、葛根、益母草、水蛭、血竭等活血化瘀以治標(biāo)。諸藥合用，標(biāo)本兼治，補(bǔ)氣而不壅滯，化瘀而不傷正，從而改善氣虛血瘀這一病理狀態(tài)。臨床上主要用于改善冠心病患者的臨床癥狀，改善心肌供血狀態(tài)，獲得了較好的療效[3]?，F(xiàn)代藥理研究已證實(shí)，雪蓮?fù)}丸組成藥物如川芎、西洋參等對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖具有明顯促進(jìn)作用[17]，說明其可能通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖來改善冠脈的收縮/舒張狀態(tài)，進(jìn)而改善心肌缺血狀態(tài)。同時(shí)，本方所用活血化瘀類藥物如益母草、紅花、土鱉蟲、水蛭、血竭等具有擴(kuò)張冠狀動脈、增加冠狀動脈血流量和保護(hù)冠狀動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用[16]。因此，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、抑制冠脈收縮、增加冠脈血流量、改善心肌供血供氧等綜合效應(yīng)很可能是雪蓮?fù)}丸治療冠心病氣虛血瘀證的機(jī)制所在。

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（本文編輯楊瑛）

〔通訊作者〕*胡志希，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：515800272@qq.com。

〔作者簡介〕秦漢，男，中醫(yī)學(xué)七年制在讀。

〔基金項(xiàng)目〕國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81373550）；湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（2014-201）。

〔收稿日期〕2015-09-17

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕

doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2016.02.007