肖　姮，陽仁達(dá)，田浩梅，林亞平，陳　文，劉　琴，楊茜蕓，陳楚淘*（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208）

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針刺聯(lián)合亞低溫對腦缺血/再灌注損傷大鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

肖姮，陽仁達(dá)，田浩梅，林亞平，陳文，劉琴，楊茜蕓，陳楚淘*
（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208）

〔摘要〕目的探討針刺聯(lián)合亞低溫方法對腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）損傷大鼠梗死面積比及Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響。方法將50只SD健康雄性大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取假手術(shù)組10只,余40只用Zea Longa線栓法制作大鼠大腦中動脈閉塞局灶腦I/R模型，待造模成功后，再將40只SD大鼠隨機(jī)分為模型組、針刺組、亞低溫組、針刺聯(lián)合亞低溫組，每組各10只。治療72 h后，使用TTC染色檢測腦梗死面積比、免疫組化法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組大鼠梗死面積比、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯增高，Bcl-2表達(dá)水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，各治療組大鼠梗死面積比、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；各治療組之間Bcl-2、Bax、Caspase-3的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但腦梗死面積比針刺聯(lián)合亞低溫組較針刺組和亞低溫組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論針刺聯(lián)合亞低溫治療可通過減少腦梗死面積比、提高Bcl-2表達(dá)水平、降低Bax與Caspase-3蛋白表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)對腦細(xì)胞的保護(hù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕針刺聯(lián)合亞低溫；腦缺血/再灌注損傷；腦梗死面積比；Bcl-2蛋白；Bax蛋白；Caspase-3蛋白

Effect of Acupuncture combined Hypothermia on Bcl-2, Bax and Caspase-3 Expressions of Cerebral Ischemia Reperfusion Injury Rats

XIAO Heng, YANG Renda, TIAN Haomei, LIN Yaping, CHEN Wen, LIU Qin, YANG Qianyun, CHEN Chutao*
（Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China）

〔Abstract〕Objective To investigate acupuncture combined hypothermia on infarction area ratio, Bcl-2, Bax and Caspase-3 protein expressions in rats with cerebral ischemia/ reperfusion injury. Methods 50 healthy male SD rats were given conventinal feeding for 1 week, then 10 rats were randomly selected as the sham-operation group, the other 40 rats were built middle cerebral artery occlusion focal cerebral ischemia/reperfusion models by Zeab Longa suture method. After the success of the modeling, then 40 SDrats were randomly dividedinto model group, acupuncture group, hypothermia group, the acupuncture combined hypothermia group, 10 rats in each group. After treatment for 72 h, the cerebral infarction area ratio was detected by TTC staining method. The apoptosis cell numbers of Bcl-2, Bax and Caspase-3 proteins were detected by immunohistochemical method. Results Compared with the sham -operation group, the infarction area ratio, Bax, Caspase -3 protein expressions in rats of model group were increased obviously, the Bcl-2 expression level decreased significantly, the difference was statistically significant（P＜0.05 or P＜0.01）; Compared with the model group, the infarction area ratio, Bax, Caspase-3 protein expressions in each treatment group were decreased obviously, the Bcl-2 expression level decreased significantly, the difference was statistically significant（P＜0.05 or P＜0.01）; The indexes of Bcl-2, Bax and Caspase-3 in each treatment group have no statistical significance（P＞0.05）, but the trend was that acupuncture combined hypothermia group was superior to the acupuncture group and hypothermia group. Conclusion Acupuncture combined hypothermia treatment can reduce the cerebral infarction area ratio, improve the level of the Bcl - 2 expressions and reduction of Bax and Caspase 3 protein expressions to protect brain cells.

〔Keywords〕acupuncture combined hypothermia; cerebral ischemia/reperfusion injury; cerebral infarction area ratio; Bcl-2 protein; Bax protein; Caspase-3 protein

腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）損傷是指腦缺血致腦細(xì)胞損傷，恢復(fù)血液再灌注后，其缺血性損傷反而進(jìn)一步加重的現(xiàn)象，是腦血管疾病發(fā)病的主要部分。腦I/R損傷具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)[1]。課題前期研究發(fā)現(xiàn)：針刺大椎、百會、人中穴能改善大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型大鼠神經(jīng)功能缺損、減少腦梗死面積從而對腦具有保護(hù)作用[2]。李宗敏等[3]實(shí)驗(yàn)顯示，亞低溫可使缺血半暗帶的凋亡細(xì)胞明顯減少，梗死體積縮小。本實(shí)驗(yàn)通過運(yùn)用針刺、亞低溫以及針刺聯(lián)合亞低溫三種不同療法對腦I/R損傷大鼠進(jìn)行治療，通過比較各組腦梗死面積比及Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)，探討聯(lián)合療法對腦I/R大鼠早期治療效果是否優(yōu)于單獨(dú)療法。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物選取SD大鼠50只，SPF級，雄性，體質(zhì)量250～280 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。許可證號SCXK（湘）2013-0004。

1.1.2試劑與儀器Bcl-2、Bax、Caspase-3試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；1.5%2，3，5-苯氯化四氮唑（TTC）溶液（C19H15）、4%多聚甲醛（WB0401）、DEPC水（WB0006）、PBS溶液（WB1001）（均來自維爾生物科技有限公司）；數(shù)位溫度表（TES 1310 TYPE-K，臺灣泰仕電子工業(yè)股份有限公司）；肛溫溫度計（nt,北京冀諾泰科技發(fā)展有限公司）；MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（北航公司）等。

1.2方法

1.2.1動物分組將50只SD健康大鼠于湖南中醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心常規(guī)飼養(yǎng)7 d，期間大鼠自由獲取食物與水，1周后隨機(jī)選取假手術(shù)組10只,其余40只參考Zea Longa等[4]方法制備MCAO大鼠模型，造模成功后再隨機(jī)分為模型組、針刺組、亞低溫組、針刺聯(lián)合亞低溫組，每組各10只。

1.2.2模型制備參照Zea Longa等[4]的方法，禁食12 h后,大鼠以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉，仰臥位固定于鼠板,頸正中切口，暴露右側(cè)的頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）及頸內(nèi)動脈（ICA），電凝交通動脈，結(jié)扎ECA后將其電凝，動脈夾夾閉CCA與ICA，在頸外剪一斜形切口，將3 mm單絲尼龍魚線頭端5 mm用石蠟包被，并于18 mm長度處標(biāo)記，從切口處插入，插入栓線長度自CCA分叉處算起約18～20 mm（根據(jù)動物體質(zhì)量而定），栓塞右側(cè)大腦中動脈，然后縫合皮膚，栓線尾端部分固定于皮膚上。缺血2 h后小心抽出栓線8 mm左右，即形成再灌注模型。假手術(shù)組僅插入尼龍魚線約10 mm，不栓塞，其余步驟同造模組。待大鼠呼吸、心跳等生命體征穩(wěn)定以后（即腦缺血再灌后1 h），神經(jīng)功能評分為1～3分則造模成功，用于實(shí)驗(yàn)。造模成功后大鼠在20℃環(huán)境下單籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食、水,必要時滴管喂水。

1.2.3穴位定取根據(jù)李忠仁主編[5]《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》及華興邦[6]等制定的《實(shí)驗(yàn)動物穴位圖譜》提供的方法，并模擬人體腧穴骨度分寸法量取。針刺穴位組由“大椎”（第7頸椎與第1胸椎間，背部正中）、“百會”（頂骨正中）、“人中”（唇裂鼻尖下1 mm正中處）三穴組成。

1.2.4針刺方法選取華佗牌美容針灸針（0.19×10 mm），大椎直刺3 mm；百會平刺2 mm；人中是向鼻中隔方向斜刺2 mm。針刺組和聯(lián)合組待大鼠呼吸、心跳等生命體征穩(wěn)定以后（即腦缺血再灌后1 h）,即刻針刺相應(yīng)穴位留針30 min，期間15 min后人工捻轉(zhuǎn)1 min，且按此方法針刺1次/12 h，共針刺7次。

1.2.5亞低溫方法參考舒鑫[7]、殷玉華[8]亞低溫方法并加以改良。測溫：測直腸溫度代表全身深部體溫，測鼓膜溫度代表腦組織溫度。具體步驟：待大鼠呼吸、心跳等生命體征穩(wěn)定以后（即腦I/R后1 h）,即刻將亞低溫組與針刺聯(lián)合亞低溫組大鼠放入裝有冰袋和碎冰的代謝籠中，30 min內(nèi)，大鼠肛溫應(yīng)降至（33±1）℃（電子溫度計插入大鼠肛門約5 cm）；用數(shù)位溫度表檢測大鼠鼓膜溫度，鼓膜溫度應(yīng)降至（31±1）℃。期間測溫為1次/10 min。溫度控制穩(wěn)定后，監(jiān)測肛溫與鼓膜溫度為1次/h，當(dāng)測溫時發(fā)現(xiàn)溫度超出正常范圍外可根據(jù)調(diào)整代謝籠內(nèi)冰袋數(shù)量來控制溫度，若溫度過低則用火爐復(fù)溫。持續(xù)亞低溫治療72 h。

1.3指標(biāo)檢測及方法

1.3.1腦梗死面積比連續(xù)治療72 h后，大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉,迅速斷頭取腦,用冰生理鹽水沖洗后，迅速放入-20℃冰箱內(nèi)，5 min后取出，切除額極，從視交叉水平開始間隔2 mm，連續(xù)5個冠狀腦切片，將其立即置于1.5%氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液中，37℃避光孵育15～30 min，期間，每隔5 min翻動一次組織，使其均勻接觸到染色液，染色后（正常組織染成紅色，梗死區(qū)呈現(xiàn)白色），然后置于10%甲醛4℃避光固定24 h，之后用數(shù)碼相機(jī)拍照拷入電腦，再用顯微圖像分析系統(tǒng)（IPP）采集腦切片圖，取最大缺血斷面A片梗死面積結(jié)果，按梗死面積占A片大腦總面積的百分?jǐn)?shù)表示，運(yùn)用MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)掃描計算A片梗死區(qū)面積和非梗死區(qū)面積。計算腦梗死面積比值。梗死面積按Swanson[9]方法進(jìn)行校正后計算A片梗死面積的百分比（IS%）表示梗死程度。計算公式：IS%＝（S1-Sr）/ 2S1×100%（S1：A片健側(cè)總面積；Sr：A片患側(cè)非梗死區(qū)面積）。

1.3.2免疫組化檢測Bcl-2,Bax，Caspase-3免疫組化檢測步驟如下:組織切片常規(guī)脫蠟；根據(jù)所應(yīng)用的一抗的特殊要求，對組織切片進(jìn)行預(yù)處理；3%過氧化氫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；PBS沖洗，2 min×3次；分別滴加適當(dāng)稀釋的Bcl-2,Bax，Caspase-3一抗，室溫或37℃孵育1-2 h或4℃過夜；PBS沖洗，2 min×3次；滴加Polymer Helper,室溫或37℃孵育20 min，PBS沖洗，2 min×3次；滴加Polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG,室溫或37℃孵育20～30 min,PBS沖洗，2 min× 3次；應(yīng)用DAB溶液顯色；自來水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。10×40倍光鏡下Bcl-2，Bax，Caspase-3為胞漿中有棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。采用顯微鏡及Biomias2001圖像分析系統(tǒng)，在10×40倍光學(xué)顯微鏡下，通過SONY攝像頭采集大鼠腦組織免疫組化染色圖像并進(jìn)行圖像分析。每張切片隨機(jī)選取海馬區(qū)5個非重疊的視野，長×寬：2.16 mm× 1.62 mm。用鼠標(biāo)點(diǎn)擊法計數(shù)凋亡（陽性）細(xì)胞[10]。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1針刺聯(lián)合亞低溫對腦I/R損傷大鼠腦梗死面積比的影響

各組大鼠腦組織切片經(jīng)TTC染色后,白色為梗死區(qū)域，紅色為正常區(qū)域。假手術(shù)組未見梗死灶,其余各組造模成功后皆出現(xiàn)或多或少的白色梗死灶。與假手術(shù)組比較，模型組及各治療組間大鼠梗死面積比大，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，各治療組之間大鼠梗死面積比縮小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與針刺聯(lián)合亞低溫組比較，針刺組和亞低溫組腦梗死面積比較大（P＜0.05或P＜0.01），說明針刺聯(lián)合亞低溫組優(yōu)于針刺組和亞低溫組。見表1、圖1。

表1　各組大鼠治療后腦梗死面積比的比較?。ā纒）

表1　各組大鼠治療后腦梗死面積比的比較?。ā纒）

注：與假手術(shù)組相比◆P＜0.05，◆◆P＜0.01；與模型組相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。；與針刺聯(lián)合亞低溫組相比★P＜0.05★★P＞0.01。

分組假手術(shù)組模型組針刺組亞低溫組針刺聯(lián)合亞低溫組F值P值n55555腦梗死面積比0±0 33.43±5.64◆◆18.39±10.86◆◆▲▲★22.70±4.91◆◆▲★★9.78±8.08◆▲▲22.14 0.00

圖1　各組大鼠治療后腦梗死面積TTC染色圖的比較

2.2針刺聯(lián)合亞低溫對腦I/R損傷大鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3的陽性細(xì)胞數(shù)的影響

在10×40倍光學(xué)顯微鏡下觀察，免疫組化染色后，造模組缺血周圍區(qū)可見大量陽性細(xì)胞，細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色，濃縮，致密，形態(tài)不規(guī)則，大小不一，其他正常細(xì)胞著染后細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)減少，Bax、Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；模型組與其他各組比均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；各治療組均能不同程度地提高Bcl-2表達(dá)水平、降低Bax與Caspase-3的陽性細(xì)胞數(shù)，但三組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2、圖2。

圖2　各組大鼠治療后Bcl-2、Bax、Caspase- 3的陽性細(xì)胞光鏡觀察圖（×400）

表2　各組大鼠治療后Bcl-2、Bax、Caspase-3的陽性細(xì)胞數(shù)比較　（n＝5,±s）

表2　各組大鼠治療后Bcl-2、Bax、Caspase-3的陽性細(xì)胞數(shù)比較?。╪＝5,±s）

注：與假手術(shù)組相比◆P＜0.05，◆◆P＜0.01；與模型組相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

分組假手術(shù)組模型組針刺組亞低溫組針刺聯(lián)合亞低溫組F值P值Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)60.75±28.32 24.25±17.17◆◆48.00±27.19▲50.38±22.15▲61.50±14.58▲▲3.84 0.01 Bax陽性細(xì)胞數(shù)53.00±28.90 90.50±51.02◆58.00±22.32▲55.13±17.03▲50.88±25.45▲2.15 0.08 Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)56.50±26.47 120.25±39.68◆◆57.75±23.68▲▲45.13±11.27▲▲41.88±14.90▲▲13.08 0.00

3　討論

凋亡是腦缺血后神經(jīng)元死亡的重要方式[11-12]，大量研究表明[13-15],腦I/R損傷后,凋亡細(xì)胞出現(xiàn)并逐漸增多。Bcl-2家族基因與Caspase家族共同參與了細(xì)胞凋亡中由線粒體介導(dǎo)的“內(nèi)源性途徑”。Bcl-2家族有眾多成員，如Mc1-1、NR-B、A1、Bc1-w、Bc1-x、Bax、Bad、Bim等，它們分別既有抗凋亡作用，也有促凋亡的作用。王恒[16]認(rèn)為，Bcl-2可以阻止CytC從線粒體釋放，抑制隨后發(fā)生的caspase激活，阻止神經(jīng)元的凋亡。武登華等[17]認(rèn)為，在腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中，Bcl-2是重要的細(xì)胞凋亡抑制基因，而Bax蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡的作用。Caspase-3位于細(xì)胞凋亡的下游，是各種凋亡通路的必經(jīng)之路，因此，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[18]。

缺血性腦損傷疾病的病位在腦，龐勇等[19]提出“病變在腦，首取督脈”是治療腦缺血性疾病的主要選穴原則。本實(shí)驗(yàn)主取督脈的百會、大椎、人中，是因?yàn)椋喊贂ㄎ挥陬^部巔頂，又稱三陽五會，為百脈聚會處，內(nèi)系于腦，取百會穴可以通督醒腦；大椎穴為督脈入腦之樞紐要穴，刺之可開通督脈，使氣血流暢，上行于腦，而發(fā)揮活血化瘀的作用；人中穴居口鼻之間，為督脈、手足陽明之會，針刺此穴，可調(diào)督脈之陽氣而醒腦神、開清竅。

根據(jù)國際慣用標(biāo)準(zhǔn)，目前通常將32～35℃亞低溫應(yīng)用于腦保護(hù)的研究[20]。朱軍寶等[21]對亞低溫在腦I/R損傷中的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制概括如下：（1）降低腦組織耗氧量，減少腦組織乳酸蓄積；（2）抑制自由基的生成；（3）減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載；（4）抑制興奮性氨基酸的合成與釋放；（5）減少神經(jīng)細(xì)胞蛋白破壞，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能恢復(fù)；（6）保護(hù)血腦屏障，減輕腦水腫及降低顱內(nèi)壓；（7）抑制腦I/R后的炎癥反應(yīng)；（8）抑制I/R損傷后神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。

在本實(shí)驗(yàn)中，通過研究顯示腦I/R后腦梗死面積比增大，Bax與Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)目增多，Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)減少；經(jīng)治療后各治療組的梗死面積比縮小及提高了Bcl-2蛋白表達(dá)，降低了Bax 與Caspase-3的蛋白表達(dá)，且聯(lián)合組有優(yōu)于針刺組和亞低溫組的趨勢，這為缺血性腦損傷發(fā)生后介入針刺聯(lián)合亞低溫提供了一定的參考價值，待進(jìn)一步深入研究其機(jī)制后宜及盡早介入臨床治療，實(shí)現(xiàn)對腦細(xì)胞的保護(hù)作用，提高患者的生活質(zhì)量。

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（本文編輯匡靜之）

·名醫(yī)擷華·

〔通訊作者〕*陳楚淘，男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail:451358104@qq.com。

〔作者簡介〕肖姮，女，在讀碩士研究生，研究方向：針灸治病的療效及機(jī)制研究。

〔基金項目〕國家自然科學(xué)基金項目（81303051）；湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目（201471）;中醫(yī)內(nèi)科學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助（ZYNK201501）。

〔收稿日期〕2015-10-08

〔中圖分類號〕R245.3

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.02.016