邱　云，蘇　健，龐　雪，石繼連，廖　念，周逸群*（.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南長沙40006；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙4008）

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不同炮制方法對北柴胡中柴胡皂苷a、d的含量影響

邱云1，蘇健1，龐雪2，石繼連2，廖念2，周逸群2*
（1.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南長沙410006；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙410208）

〔摘要〕目的研究北柴胡不同炮制方法（凈制、醋炙、酒炙、麩炒、鱉血炙）與有效成分柴胡皂苷a、d的相關(guān)性，為闡明炮制機(jī)理和炮制品的不同功效奠定基礎(chǔ)。方法采用高效液相色譜法進(jìn)行測定，Hypersil ODS C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），乙腈-水為流動相梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，測定波長210 nm，進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果不同柴胡炮制品之間柴胡皂苷a和d的含量差異較大，柴胡皂苷a的含量依次為：麩炒柴胡＞生柴胡＞醋柴胡＞酒柴胡＞鱉血柴胡，柴胡皂苷d的含量依次為：生柴胡＞麩炒柴胡＞醋柴胡＞酒柴胡＞鱉血柴胡。結(jié)論不同炮制方法對柴胡有效成分柴胡皂苷a、d有一定影響。

〔關(guān)鍵詞〕柴胡；炮制；柴胡皂苷a；柴胡皂苷d；含量測定；影響

Influence of Different Processing Methods on Content of Saikosaponin a and Saikosaponin d from Bupleurum chinense

QIU Yun1, SU Jian1, PANG Xue2, SHI Jilian2, LIAO Nian2, ZHOU Yiqun2*
（1.The Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medical Sciences, Changsha, Hunan 410006, China; 2.Department of Pharmaceutics, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China）

〔Abstract〕Objective To study the correlation of different processing methods（cleansing, vinegar-stir-fried, wine-stirfried, bran-stir-fried, turtle blood-stir-fried）of Bupleurum chinense and the constituents saikosaponin a and saikosaponin d and lay the foundation for different effects of processed products. Methods HPLC method was used with Hypersil ODS C18column（4.6 mm×200 mm, 5 μm）, water and methanol as solvent system with gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/mL, column temperature was 30℃, detection wavelength was set at 210 nm，and injection volume was 20 μL. Results The contents of total saponins in different processed products of Bupleurum chinense were different. The content of saikosaponin a was as follows: bran-stir-fried＞cleansing＞vinegar-stir-fried＞wine-stir-fried＞turtle blood-stir-fried. The content of saikosaponin d was as follows: cleansing＞bran-stir-fried＞vinegar-stir-fried＞wine-stir-fried＞turtle blood-stir-fried. Conclusion The method was simple and reliable, and used to determine the main contents of Bupleurum chinense and its four processed products.

〔Keywords〕Bupleurum Radix; processed products; saikosaponina; saikosaponind; constituents; effect

柴胡為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC）或狹葉柴胡（Bupleurum scozonerifolium Willd.）的干燥根，前者習(xí)稱“北柴胡”，后者習(xí)稱“南柴胡”，其中北柴胡為臨床常用品種。具有和解退熱、疏肝解郁、升舉陽氣的作用，主要用于感冒發(fā)熱、寒熱往來、瘧疾、肝郁氣滯、胸肋脹痛、脫肛、子宮脫落、月經(jīng)不調(diào)[1]。柴胡皂苷a、d等皂苷類成分是其主要生物活性成分[2]。除生品外，臨床上常用其醋炙品等不同炮制品入藥[3]。由于在炮制過程中不同炮制品的加熱程度、加熱輔料等不同，其所含化學(xué)成分的量也不同[4]。為了考察不同炮制方法對其主要活性成分的含量影響，本研究采用HPLC測定了柴胡生品、醋炙品、酒炙品、麩炒品及鱉血炙品中柴胡皂苷a、d的含量。

1　材料

1.1藥材與試劑

柴胡藥材購自于長沙市高橋藥材市場，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)周日寶教授鑒定為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）的干燥根。柴胡皂苷a對照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，上海源葉生物科技有限責(zé)任公司，批號PN1113SA13）、柴胡皂苷d對照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，上海源葉生物科技有限責(zé)任公司，批號HJ0604XB13）。米醋（釀造食醋，山西六味齊新源醋業(yè)有限公司，批號20140919），黃酒（鎮(zhèn)江恒順酒業(yè)有限責(zé)任公司，批號20141129），新鮮鱉血（鱉科動物中華鱉的新鮮血液），甲醇、濃氨水均為分析純，乙腈為色譜純，流動相用水為雙重蒸餾水。

1.2主要儀器

D2F-6050型恒溫干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；MA110型電子分析天平（上海天平儀器廠）；Waters1525型高效液相色譜儀，檢測器：Waters 2487。

2　方法與結(jié)果

2.1不同炮制品的制備

2.1.1生柴胡[5]取柴胡干燥藥材，除去雜質(zhì)和殘莖，洗凈，潤透，切段，干燥，即得。

2.1.2醋柴胡[5]取凈生柴胡300 g，加米醋60 g拌勻，悶透，置鍋內(nèi)用文火炒干時(shí)，出鍋，放涼，即得。

2.1.3酒柴胡[5]取凈生柴胡300 g，加入黃酒30 g拌勻，悶透，置鍋內(nèi)用文火炒干時(shí)，出鍋，放涼，即得。

2.1.4麩炒柴胡[6]取麥麩30 g撒在熱鍋中，待麥麩起煙時(shí)，投入凈生柴胡300 g，用文火翻炒至表面呈微黃色，出鍋，篩去麥麩，放涼，即得。

2.1.5鱉血柴胡[6]取凈生柴胡460 g，加入新鮮鱉血60 g及適量冷開水拌勻，悶潤至鱉血液被柴胡吸盡，置炒制容器內(nèi)，用文火加熱炒干，出鍋，放涼，即得。

2.2指標(biāo)成分的含量測定[7]

2.2.1對照品溶液的制備精密稱取柴胡皂苷a 0.010 1 g、柴胡皂苷d 0.010 1 g分別置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別得到濃度為1.01 mg/mL的柴胡皂苷a對照品溶液和濃度為1.01 mg/mL的柴胡皂苷d對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備取“2.1”項(xiàng)下制備的柴胡不同炮制品粉末（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，分別加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25 mL，密塞，30℃水溫超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）30 min，濾過，用甲醇20 mL 分2次洗滌容器及藥渣，洗液與濾液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑至干。殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3色譜條件色譜柱：Hypersil ODS C18 （4.6 mm×200 mm，5 μm）；柱溫：30℃；測定波長：210 nm；流動相：乙腈-水，采用梯度洗脫：當(dāng)時(shí)間為0、5、10、15、20、25、35、40、45、50 min時(shí)，乙腈比例分別為10%、20%、35%、40%、45%、50%、75%、85%、95%、100%；流速：1.0 mg/mL；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.4線性關(guān)系試驗(yàn)分別配置1.00、0.50、0.10、0.05、0.01 mg/mL的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對照品溶液，進(jìn)樣量為20 μL，，注入液相色譜儀，記錄色譜圖（見圖1）。以峰面積Y、對照品濃度X計(jì)算線性回歸方程：柴胡皂苷a：Y＝5 900 000X-1 511.3（r＝0.999 8）；柴胡皂苷d：Y＝7 600 000X-110 000（r＝0.999 9），表明柴胡皂苷a和柴胡皂苷d在0.01～1.00 mg/mL范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

圖1　柴胡皂苷對照品色譜圖

2.2.5精密度試驗(yàn)精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下制備的同一批供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定柴胡皂苷a色譜峰面積的RSD為0.83%，柴胡皂苷d色譜峰面積的RSD為0.64%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下制備的同一供試品溶液，室溫放置，分別于0、1、4、8、12、24 h按“2.2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣20 μL，測定柴胡皂苷a色譜峰面積的RSD為1.02%，柴胡皂苷d色譜峰面積的RSD為0.57%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7重復(fù)性試驗(yàn)取同一批柴胡炮制品按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣20 μL，測定柴胡皂苷a含量的RSD為1.21%，柴胡皂苷d含量的RSD為0.79%，表明本法重復(fù)性良好。

2.2.8加樣回收率試驗(yàn)取柴胡同一炮制品粉末6份，每份約0.25 g，已知該粉末中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量分別為8.285 mg/g和6.518 mg/g，精密稱定后分別加入柴胡皂苷a對照品和柴胡皂苷d對照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見表1。由表1可知，柴胡皂苷a的平均加樣回收率為98.63%，RSD 為1.29%，柴胡皂苷d的平均加樣回收率為98.47%，RSD為1.23%，表明柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的回收率好。

表1　柴胡皂苷a和柴胡皂苷d加樣回收試驗(yàn)測定結(jié)果

2.2.9含量測定取柴胡不同炮制品粉末約0.5 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，平行3份，在“2.2.3”項(xiàng)下條件下分別進(jìn)樣20 μL，得到HPLC圖譜（圖2），分別計(jì)算柴胡不同炮制品中柴胡皂苷a及柴胡皂苷d的百分含量。結(jié)果見表2。

S1空白試劑；S2生柴胡；S3酒柴胡；S4麩炒柴胡；S5醋柴胡；S6鱉血柴胡1.柴胡皂苷a；2.柴胡皂苷d圖2　柴胡不同炮制品HPLC色譜圖

表2　柴胡皂苷百分含量測定結(jié)果?。╪＝3，%）

3　討論

3.1洗脫梯度的確定

《中華人民共和國藥典》一部柴胡項(xiàng)下收載的HPLC梯度洗脫條件適用于生柴胡飲片，對本實(shí)驗(yàn)中的柴胡不同炮制品分離效果不佳，故在此基礎(chǔ)上以乙腈、水作二元混合溶劑，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得到新的洗脫梯度，可以提高分離度和峰的對稱性，降低最低檢測量，提高檢測靈敏度，為柴胡炮制品的研究提供方法。3.2炮制方法對柴胡皂苷的影響

從表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，柴胡皂苷a含量：麩炒＞生品＞醋炙＞酒炙＞鱉血炙。柴胡皂苷d含量：生品＞麩炒＞醋炙＞酒炙＞鱉血炙。即除麩炒可增加柴胡中柴胡皂苷a的含量之外，其他炮制方法均可降低柴胡中柴胡皂苷a、d的含量。由此可知，不同的炮制方法對柴胡中柴胡皂苷a、d的含量確有不同影響。柴胡經(jīng)不同方法炮制后，其所含的主要有效成分發(fā)生變化，導(dǎo)致不同炮制品的臨床功效不盡相同且各有所長，故臨床上將不同柴胡炮制品分別入藥應(yīng)用具有一定科學(xué)道理。

麩炒柴胡為湖南地區(qū)慣用品種，僅收載于《湖南省中藥飲片炮制規(guī)范》2010年版，目前已有文獻(xiàn)研究醋炙、酒炙、鱉血炙等炮制方法對柴胡有效成分的影響，而麩炒對柴胡有效成分影響的研究迄今未見報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，麩炒可增加柴胡中柴胡皂苷a的含量，原因可能是炮制過程中化學(xué)變化或者炮制輔料麥麩的殘留引起，為湖南地區(qū)常用麩炒柴胡提供了一定的依據(jù)。為了闡明其炮制機(jī)制，建立柴胡麩炒炮制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)進(jìn)步研究麥麩濃煙熏炒的炮制方式對柴胡皂苷及揮發(fā)性成分的影響。

參考文獻(xiàn)：

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[7]李騰，高展，孫玉俠，等.柴胡及其制劑中皂苷類成分的研究[J].中成藥，2011，33（11）：1 840-1 843.

（本文編輯蘇維）

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〔通訊作者〕*周逸群，女，碩士，助教，E-mail：zhouyiqun123@sina.com。

〔作者簡介〕邱云，女，碩士，中藥師，主要從事中藥炮制、制劑與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

〔基金項(xiàng)目〕湖南省中醫(yī)藥研究院院級課題（201312）；湖南省教育廳一般項(xiàng)目（15C1039），國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制學(xué)重點(diǎn)學(xué)科（國中醫(yī)藥人教發(fā)[2012]32號）；湖南省“十二五”重點(diǎn)學(xué)科中藥學(xué)專業(yè)資助（湘教發(fā)[2011] 76號）。

〔收稿日期〕2015-06-03

〔中圖分類號〕R284.1; R283

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.02.014