李 嬌，謝金文，李 峰，沈志強(qiáng)，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒株鑒別檢測方法研究進(jìn)展

李 嬌1，謝金文2，李 峰2，沈志強(qiáng)1，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

為配合PRV（豬偽狂犬病病毒）gE基因缺失疫苗的推廣應(yīng)用，及時、準(zhǔn)確地淘汰PRV強(qiáng)毒感染豬，逐步實現(xiàn)PRV的凈化，急需加強(qiáng)PRV強(qiáng)毒株鑒別診斷方法的研究開發(fā)與推廣應(yīng)用。文章就近年來針對PRV強(qiáng)毒株各種鑒別診斷方法的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為我國PR（豬偽狂犬病）綜合防控措施的制定提供參考依據(jù)。

豬偽狂犬病病毒；強(qiáng)毒株；鑒別診斷方法；研究進(jìn)展

豬偽狂犬病（Pseudorabies,PR）是由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的以母豬繁殖障礙、仔豬高病死率和呼吸道疾病為主要特征的一種急性、敗血性傳染病[1-2]。該病于1902年被首次發(fā)現(xiàn)，我國于1947年首次報道。自20世紀(jì)90年代以來我國全面推廣使用PRV gE基因缺失疫苗，由于該疫苗具有良好的免疫原性，我國有效地控制了該病的發(fā)生與流行[3]。但自2011年以來，我國多個省份陸續(xù)暴發(fā)PR疫情或PRV gE基因缺失疫苗免疫豬場突然野毒抗體轉(zhuǎn)陽，PR在我國發(fā)病率和死亡率明顯升高[4]，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PR將是未來幾年內(nèi)危害我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要疫病之一，故加強(qiáng)PRV強(qiáng)毒株鑒別診斷技術(shù)的研究對保障我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展至關(guān)重要。本文就近年來針對PRV強(qiáng)毒株各種鑒別診斷方法的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為我國PR綜合防控措施的制定提供參考依據(jù)。

1 PCR方法

趙雪麗等[5]根據(jù)PRV強(qiáng)毒具有g(shù)D表面抗原基因和gE毒力基因，而基因缺失疫苗只有g(shù)D基因無gE基因的特性，針對gD/gE基因的5′端核苷酸序列分別設(shè)計引物，建立鑒別PRV gE基因缺失疫苗和強(qiáng)毒感染的二重PCR診斷方法，該方法最低檢出限為100拷貝/μL，可特異性地擴(kuò)增出PRV細(xì)胞毒中的gD和gE基因及gE基因缺失疫苗毒中的gD基因，但對PK-15細(xì)胞和豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細(xì)小病毒（PPV）、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬鏈球菌（S.suis）、副豬嗜血桿菌（HPS）等病原的檢測均為陰性。對835份臨床疑似PR感染病料中共檢測出PRV gD和gE基因雙陽性樣品即強(qiáng)毒感染陽性樣品267份，隨機(jī)選取該方法檢測出的26份PRV強(qiáng)毒感染樣品用于病原分離培養(yǎng)，兩種方法的符合率為96.1%。建立的PRV gE基因缺失疫苗和強(qiáng)毒感染的快速鑒別診斷方法靈敏、特異，對于臨床上疫苗毒和強(qiáng)毒感染的快速鑒別診斷具有重要意義。張志等[6]以疫苗株缺失的3.5 kb片段為靶基因，設(shè)計了2對PCR引物，建立了能夠特異性檢測PRV強(qiáng)毒株的套式PCR方法。該方法檢測極限可達(dá)10拷貝/μL，敏感性是常規(guī)PCR方法的1 000倍，并與CSFV、PRRSV、PPV和PCV2等不存在交叉反應(yīng)。檢測150份臨床樣品，套式PCR方法的陽性率為21.33%，常規(guī)PCR方法的陽性率僅為10%。該方法具有特異性高、敏感性強(qiáng)的特點(diǎn)，是一種值得基層推廣應(yīng)用的快速診斷技術(shù)，可用于PRV的診斷和流行病學(xué)調(diào)查等。PCR方法操作簡單、檢測快速、敏感、特異，套式PCR方法的敏感性更高，適合于基層實驗室進(jìn)行PRV強(qiáng)毒株感染的快速診斷與流行病學(xué)調(diào)查等。

2 熒光定量PCR方法

實時熒光定量PCR方法是結(jié)合常規(guī)PCR技術(shù)和光譜技術(shù)發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)定量檢測技術(shù)，與常規(guī)PCR方法相比具有敏感性更高、全封閉反應(yīng)、不需核酸電泳檢測、適時定量等優(yōu)點(diǎn)。呂素芳等[7]根據(jù)PRV強(qiáng)毒SA株的gD和gE基因序列設(shè)計引物，并對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了檢測PRV gE基因缺失病毒株的SYBR GreenⅠ實時定量PCR方法，其靈敏度比傳統(tǒng)PCR方法高100倍，檢測PCV2、PPV、CSFV、PRRSV均為陰性，可用于病原學(xué)監(jiān)測、流行病學(xué)調(diào)查及定量研究。陳如敬等[8]根據(jù)PRV gE基因序列設(shè)計特異性實時熒光定量引物，建立基于SYBR GreenⅠ染料的PRV實時熒光定量PCR方法，該方法檢測PRV gE基因在7.53×10-1～7.53×10-6拷貝/μL范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，檢測PCV2、PPV、S.suis、HPS核酸均為陰性，組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為0.31%～1.14%和0.42%～1.74%，該方法敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，為深入開展PRV強(qiáng)毒感染的診斷以及對宿主致病機(jī)制的研究提供了檢測手段。余波等[9]根據(jù)PRV gE基因序列設(shè)計特異性的引物，PCR擴(kuò)增獲得PRV gE基因片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-gE作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，對SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立PRV SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR診斷方法，組裝了診斷試劑盒，該試劑盒在4℃保存1年陽性拷貝數(shù)降低100倍，在-20℃保存1年陽性拷貝數(shù)檢測的偏差在10個拷貝數(shù)以內(nèi)。該試劑盒特異、靈敏、快速、重復(fù)性好，適于PRV野毒株臨床樣品的檢測，可應(yīng)用于PRV野毒株早期感染和潛伏感染檢測，有利于PR的凈化。熒光定量PCR方法的靈敏度更高，但該方法對儀器設(shè)備和操作人員技術(shù)水平要求較高，一般基層實驗室由于不具備試驗條件而無法開展。

3 LAMP方法

張莉等[10]針對PRV gE基因保守區(qū)域設(shè)計并合成了4條引物，建立了PRV野毒株的LAMP檢測方法，并進(jìn)行了特異性、敏感性和重復(fù)性試驗，該方法可特異性地檢測PRV強(qiáng)毒株，檢測PRRSV、PPV、CSFV、豬流感病毒（SIV）、PRV gE基因缺失疫苗株均為陰性。該方法的最低檢測量可達(dá)100個拷貝質(zhì)粒DNA，比常規(guī)PCR方法的敏感性高10倍。該LAMP方法具有較高的特異性、敏感性和可重復(fù)性，可用于偽狂犬病病毒的快速診斷。LAMP方法無需PCR儀等儀器設(shè)備，僅需1個恒溫水浴鍋即可完成整個反應(yīng)過程，操作簡單，檢測快速，非常適合于基層獸醫(yī)實驗室和養(yǎng)殖場開展PRV強(qiáng)毒株的鑒別診斷。

4 核酸探針方法

核酸探針技術(shù)是近幾年迅速發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，劉志杰[11]通過PCR方法擴(kuò)增了304 bp的PRV gE基因片段，將其作為核酸探針來對PRV野毒株進(jìn)行檢測，該探針只與PRV野毒株gE基因同源DNA出現(xiàn)陽性雜交信號，而與PRV gE基因缺失疫苗株、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV的雜交結(jié)果均為陰性，該探針最低可檢出4 pg的同源DNA，具有很高的特異性和敏感性，可用于PRV野毒株的檢測。核酸探針方法根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，特異性更強(qiáng)，敏感性更高，但操作復(fù)雜、繁瑣，專業(yè)人員需要一定的技術(shù)水平，一般實驗室很難具備試驗條件。

5 ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）方法

雷有玲等[12]參照已發(fā)表的PRV基因組gE基因序列，設(shè)計合成1對特異性引物，PCR擴(kuò)增了長約606 bp的gE基因片段，將目的片段亞克隆至pET30a原核表達(dá)載體中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組gE蛋白的表達(dá)，重組蛋白純化后，免疫印跡檢測證明具有良好的抗原性和特異性。以純化蛋白為包被抗原，經(jīng)間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測PRV野毒抗體的間接ELISA方法，該方法檢測豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、PPV、PRRSV、CSFV、PCV2、PRV疫苗毒的陽性血清均為陰性，批內(nèi)與批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)分別小于5%和10%，與IDEXX gE-ELISA抗體檢測試劑盒的符合率為96.2%。該gE-ELISA檢測方法為PRV野毒抗體檢測以及野毒感染的快速診斷與流行病學(xué)調(diào)查等提供了一種簡便、快速、高通量的血清學(xué)檢測方法。吳程華等[13]采用gE-ELISA檢測方法對云南省楚雄地區(qū)散養(yǎng)戶PRV野毒感染情況進(jìn)行調(diào)查，楚雄地區(qū)9個散養(yǎng)戶154份血清樣本中，抗PRV gE抗體的陽性率為25.32%，表明楚雄地區(qū)散養(yǎng)戶PRV野毒株感染率較高。黨占國等[14]采用gE-ELISA檢測方法對2012—2015年16個省240個規(guī)?；i場的7 443份血清樣品進(jìn)行PRV野毒抗體的檢測，2012年、2013年、2014年、2015年P(guān)RV野毒感染抗體陽性率分別為39.4%、39.6%、43.8%、50.8%，表明我國豬場豬偽狂犬病野毒感染呈逐年上升趨勢，感染依然嚴(yán)重。ELISA方法操作簡單、檢測快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，非常適用于大批量樣品的檢測，在基層獸醫(yī)部門進(jìn)行大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查中得到了廣泛應(yīng)用，具有良好的應(yīng)用前景。

6 膠體金免疫層析法

白靜等[15]采用PCR方法擴(kuò)增了600 bp的gE基因片段，將其克隆至pET-22b原核表達(dá)載體中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組gE蛋白的表達(dá)，蛋白質(zhì)斑點(diǎn)雜交結(jié)果顯示重組蛋白具有良好的抗原性。利用金屬螯和層析柱對重組蛋白進(jìn)行純化后，獲得了抗原濃度為1.25 mg/mL的純化抗原，以檸檬酸鈉還原法制備了直徑為15～20 nm的膠體金顆粒，將純化蛋白透析后用膠體金顆粒進(jìn)行標(biāo)記，將純化蛋白透析后噴膜形成抗原線，并以PRV多克隆抗體噴膜形成質(zhì)控線，組裝了檢測PRV野毒抗體的膠體金試紙條。該試紙條檢測CSFV、PRV gE基因缺失疫苗株、PPV、豬喘氣病、豬萎縮性鼻炎等均為陰性，該試紙條與美國IDEXX酶聯(lián)免疫試劑符合率在98%以上。膠體金免疫層析法具有快速、簡便、靈敏、特異性好等特點(diǎn)，無需任何設(shè)備20 min內(nèi)可出檢測結(jié)果，非常適用于基層實驗室和養(yǎng)殖戶。

7 小結(jié)與展望

為配合PRV gE基因缺失疫苗在我國的推廣應(yīng)用，及時、準(zhǔn)確地淘汰PRV野毒感染豬，逐步實現(xiàn)PR的凈化，急需加強(qiáng)PRV野毒株鑒別診斷技術(shù)的研究開發(fā)與推廣應(yīng)用。在PRV的強(qiáng)毒鑒別診斷方法中，常規(guī)PCR方法操作簡單、檢測快速，是目前PRV病原學(xué)調(diào)查采用的主要方法，但該方法敏感性低于熒光定量PCR、核酸探針、LAMP等方法，容易出現(xiàn)漏檢。熒光定量PCR方法彌補(bǔ)了常規(guī)PCR方法不能定量的缺點(diǎn)，且其敏感性大幅提高，但該方法對儀器、試劑、操作人員的要求均較高，限制了在基層獸醫(yī)部門的推廣應(yīng)用。核酸探針和LAMP方法均是新興的分子生物學(xué)檢測方法，對儀器、試劑、操作人員的要求較低，但敏感性太高，易導(dǎo)致假陽性結(jié)果。ELISA方法操作簡單、高通量，是目前PRV野毒抗體檢測和血清學(xué)調(diào)查的主要方法。膠體金免疫層析方法較ELISA方法操作更簡單、檢測更快速、成本更低廉，但ELISA和膠體金免疫層析方法等血清學(xué)方法不能檢測到PRV強(qiáng)毒的早期感染和潛伏感染。綜合判斷，PRV野毒株的各種鑒別診斷方法均具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，檢測人員可根據(jù)自身試驗條件選擇適合的方法。相信隨著分子生物學(xué)和血清學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，PRV強(qiáng)毒鑒別診斷方法亦會得到不斷完善，不斷為PR的診斷、流行病學(xué)調(diào)查、綜合防控、凈化提供保障。

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（編輯：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)06-0090-03

2016-09-07

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊項目（SDAIT-06-022-15）

李 嬌（1981-），女，滿族，遼寧鐵嶺人，助理研究員，碩士，主要從事動物疫病診斷技術(shù)研究.E-mail:lijiao_zone@163.com