祖立闖,李 嬌，謝金文，李 峰，沈志強(qiáng)，

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豬瘟病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展

祖立闖1,李 嬌1，謝金文2，李 峰2，沈志強(qiáng)1，2

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豬瘟（Classical swine fever,CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病，豬瘟的發(fā)病率和死亡率都很高，是目前危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重要病毒性傳染病之一[1]。多年來(lái)，我國(guó)自主研發(fā)的豬瘟兔化弱毒疫苗，對(duì)豬瘟的防控起到了重要作用。但隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；目焖侔l(fā)展，豬瘟出現(xiàn)新的變異和非典型的臨床癥狀，綜合防控難度逐步增加，給豬瘟的實(shí)驗(yàn)室診斷提出了更高要求。鑒于此，筆者查閱大量相關(guān)資料，對(duì)豬瘟病毒的各種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法進(jìn)行綜述，以期為豬瘟的臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷提供參考。

1 RT-PCR方法

RT-PCR方法是豬瘟病毒實(shí)驗(yàn)室診斷的常用方法，豬瘟病毒屬于RNA病毒，須先利用RNA提取試劑提取樣品中的病毒基因組RNA，在體外利用反轉(zhuǎn)錄酶將病毒基因組RNA合成cDNA，通過(guò)目的片段的體外PCR擴(kuò)增和核酸電泳檢測(cè)實(shí)現(xiàn)病毒核酸的分子生物學(xué)檢測(cè)。檢測(cè)樣品可以是組織病料，也可以是血液樣品。陳本龍等[2]根據(jù)Genbank上發(fā)表的豬瘟病毒全基因組序列和豬瘟病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的特異性基因序列各設(shè)計(jì)1條上游檢測(cè)引物，同時(shí)在保守序列區(qū)設(shè)計(jì)1條強(qiáng)毒株和弱毒株共用的下游引物，建立了一種能夠區(qū)別豬瘟強(qiáng)毒株和弱毒株的鑒別RTPCR檢測(cè)方法，強(qiáng)毒株和弱毒株分別擴(kuò)增出680 bp和785 bp的特異性片段，該方法最低可以檢出0.5 pg的豬瘟病毒基因組RNA，有很高的特異性和敏感性，可以用于豬瘟的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。

2 RT-nPCR方法

RT-nPCR方法為復(fù)合套式RT-PCR反應(yīng)，是在第1輪RT-PCR反應(yīng)內(nèi)部設(shè)計(jì)引物，以第1輪RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。吳旭錦等[3]建立了一種基于豬瘟病毒保守的E0基因的RT-nPCR檢測(cè)方法，該方法檢測(cè)CSFV cDNA含量的最低極限為6.7×10-5ng/L，與牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）和豬細(xì)小病毒（PPV）無(wú)交叉反應(yīng)，臨床檢測(cè)32份疑似豬瘟病毒感染組織病料，有12份呈現(xiàn)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為37.5%。建立的RT-nPCR檢測(cè)方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，可作為豬瘟病毒的臨床診斷方法，為豬瘟的防控提供參考。

3 熒光定量RT-PCR方法

熒光定量RT-PCR方法是在普通RT-PCR方法的基礎(chǔ)上引入熒光染料，通過(guò)熒光PCR儀進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增，比普通的RT-PCR方法更加敏感。余以剛等[4]建立了豬瘟病毒野毒株和疫苗株熒光RT-PCR鑒別方法，該方法對(duì)野毒株和疫苗株的檢測(cè)靈敏度分別達(dá)到1 TCID50/mL和0.1 TCID50/mL，組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)在0.7%～2.2%之間，對(duì)豬肉、脾臟和血液病料進(jìn)行豬瘟野毒檢測(cè)的陽(yáng)性率分別為66.7%、60.0%、77.8%，而常規(guī)RT-PCR方法的陽(yáng)性率分別為52.4%、40.0%、50.0%，檢出率比常規(guī)RTPCR方法要高。岳鋒等[5]根據(jù)豬瘟病毒5'UTR的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，建立了檢測(cè)豬瘟病毒的熒光定量RT-PCR方法，該方法最低檢測(cè)限為1×101拷貝/μL，檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒均為陰性，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2%，具有特異、敏感、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，為豬瘟病毒的臨床快速診斷提供了一種敏感、準(zhǔn)確和快速的檢測(cè)方法。

4 RT-LAMP方法

RT-LAMP是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，是一種新型的、能在基層場(chǎng)地進(jìn)行實(shí)時(shí)便捷診斷的豬瘟病毒檢測(cè)方法。通過(guò)設(shè)計(jì)豬瘟病毒特異性檢測(cè)引物和探針，恒溫進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，不需要PCR儀等特殊的儀器設(shè)備，通過(guò)加入熒光染料對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行肉眼判讀，檢測(cè)結(jié)果直觀，適合臨床和基層應(yīng)用。袁向芬等[6]根據(jù)豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的保守序列分別設(shè)計(jì)一套LAMP檢測(cè)引物，在同一體系中進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了可以在63℃恒溫下進(jìn)行豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征病毒同步檢測(cè)的RT-LAMP檢測(cè)方法，該方法與熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的符合率為100%，可以用于臨床兩種病原的同步快速檢測(cè)。朱俊靈等[7]根據(jù)豬瘟病毒NS5B基因設(shè)計(jì)特異性引物及生物素標(biāo)記探針，結(jié)合異硫氰酸熒光素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，建立了豬瘟病毒的RT-LAMP-LFD檢測(cè)方法，該方法可以特異檢出豬瘟病毒，對(duì)RNA的最低檢測(cè)限為50 pg，反應(yīng)快速，整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)可在1 h內(nèi)完成，操作簡(jiǎn)單，不需要PCR儀等復(fù)雜的儀器，滿足基層檢疫的需要，是一種新型的、能在基層場(chǎng)地進(jìn)行實(shí)時(shí)便捷診斷的豬瘟病毒檢測(cè)方法。

5 ELISA方法

ELISA方法可以用于豬瘟病毒抗原和抗體的檢測(cè)，具有敏感、特異、操作簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，其結(jié)果具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可以用于實(shí)驗(yàn)室樣品的批量檢測(cè)。唐紅慧等[8]應(yīng)用進(jìn)口豬瘟抗原/血清ELISA試劑盒對(duì)21份豬瘟成品疫苗進(jìn)行病毒抗原含量測(cè)定，與兔體定型熱反應(yīng)相比，兩者符合率高達(dá)95.8%，表明ELISA方法可以用于豬瘟疫苗的病毒含量測(cè)定。蔣卉等[9]采用豬瘟抗體IDEXX ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)注射豬瘟病毒的家兔血清樣品進(jìn)行抗體檢測(cè)，通過(guò)與家兔體溫反應(yīng)做比較，兩者有很高的正相關(guān)性，符合率為95.83%。ELISA方法可以用于豬瘟疫苗檢驗(yàn)的替代方法。吳立君[10]應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)豬瘟病毒抗體水平，通過(guò)ELSIA方法進(jìn)行疾病檢測(cè)在臨床上有很好的應(yīng)用，對(duì)豬場(chǎng)的豬病防控起到很好的指導(dǎo)作用。

6 正向間接血凝方法

正向間接血凝方法的原理是將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當(dāng)大小的顆粒性載體的表面，然后與相應(yīng)抗體或抗原作用，在適宜的電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象。血凝試驗(yàn)是紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)的簡(jiǎn)稱，間接血凝試驗(yàn)是以紅細(xì)胞作為載體的間接凝集試驗(yàn)，用已知血凝抗原檢測(cè)未知血清抗體的試驗(yàn)，稱為正向間接血凝試驗(yàn)，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用廣泛。呂曉娟等[11]應(yīng)用正向間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)豬瘟免疫抗體，應(yīng)用該方法對(duì)5個(gè)規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)和5個(gè)散養(yǎng)戶的200份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，規(guī)模豬場(chǎng)抗體滴度集中在7 log2～8 log2之間，抗體滴度在5 log2～6 log2和9 log2～10 log2之間的較少，抗體不合格的只有4份，豬瘟抗體的合格率（抗體滴度≥5 log2）為96%，散養(yǎng)戶的豬瘟抗體滴度比較分散，抗體滴度在5 log2～6 log2和7 log2～8 log2之間的居多，9 log2～10 log2之間的很少，豬瘟抗體的合格率為85%。正向間接血凝方法操作簡(jiǎn)單，所需要的儀器設(shè)備少，快速、靈敏、特異，適合基層推廣應(yīng)用。

7 小結(jié)與展望

豬瘟目前仍是危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的頭號(hào)殺手，清除和控制豬瘟的發(fā)生，需要從多方面提高豬瘟的防控水平，構(gòu)建準(zhǔn)確、實(shí)用性高的豬瘟病毒檢測(cè)方法對(duì)實(shí)現(xiàn)豬瘟的凈化至關(guān)重要。本文詳細(xì)介紹了豬瘟病毒各種檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)以及最新研究進(jìn)展，其中RT-PCR方法敏感性有限，容易漏檢，且不能定量；RT-LAMP方法靈敏度太高，易導(dǎo)致假陽(yáng)性；熒光定量RT-PCR方法敏感性高、全封閉反應(yīng)，有效解決了RT-PCR方法容易漏檢以及RT-LAMP方法容易污染的問(wèn)題，且能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)病毒含量的定量檢測(cè)，是目前豬瘟病毒檢測(cè)中最準(zhǔn)確的方法，雖然該方法對(duì)儀器、試劑、技術(shù)人員水平要求較高，但隨著我國(guó)基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)的不斷完善，該方法將逐步成為豬瘟病毒臨床診斷最適合的方法。正向間接血凝方法和ELISA方法等血清學(xué)檢測(cè)方法不能區(qū)分強(qiáng)毒株感染抗體與疫苗免疫抗體，無(wú)法實(shí)現(xiàn)豬瘟病毒強(qiáng)毒株感染的鑒別診斷，但血清學(xué)方法操作簡(jiǎn)單、高通量，可在豬瘟疫苗免疫后的抗體監(jiān)測(cè)中推廣應(yīng)用。故在臨床應(yīng)用中建議采用血清學(xué)方法對(duì)豬瘟疫苗免疫效果進(jìn)行監(jiān)測(cè)，建議采用熒光定量RT-PCR方法對(duì)豬瘟病毒感染的疑似病例進(jìn)行確診，進(jìn)而提高豬瘟病毒檢測(cè)的準(zhǔn)確性，準(zhǔn)確淘汰強(qiáng)毒感染豬，減少免疫豬被誤殺，為豬瘟的凈化提供技術(shù)保障。

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（編輯：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)06-0117-02

2016-09-22收稿，2016-10-11修回

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-06-022-15）

祖立闖（1981-），男，黑龍江賓縣人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物疫病診斷技術(shù)研究.E-mail:zulichuang2008@126.com