路鳳珍，張娜，田淑芬*，溫曉敏，陳三春（. 天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究中心/天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點實驗室，天津 30092；2. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

三倍體葡萄胚挽救育種研究現(xiàn)狀與展望

路鳳珍1，2，張娜1，田淑芬1*，溫曉敏1，2，陳三春1，2
（1. 天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究中心/天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點實驗室，天津 300192；2. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

綜合分析國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，闡述了三倍體葡萄胚挽救技術(shù)的研究進(jìn)展，探討了影響三倍體葡萄胚挽救育種成功的主要因素：親本選擇、接種時期、培養(yǎng)基種類等，概述了三倍體葡萄鑒定方法，馴化移栽過程中的影響因素，包括基質(zhì)類型、生根粉濃度等，并對胚挽救技術(shù)在三倍體葡萄育種上的發(fā)展進(jìn)行展望。

三倍體葡萄；胚挽救技術(shù)；育種；研究進(jìn)展

多倍體育種是培育果樹新品種重要途徑之一，三倍體葡萄因具有無核或少核、果粒大、產(chǎn)量高、植株生長旺盛等優(yōu)良特性，使其成為葡萄育種的目標(biāo)之一，目前二倍體與四倍體進(jìn)行有性雜交是獲得三倍體葡萄的有效途徑，其次還可以通過二倍體品種間雜交、自然選育、三倍體芽變、核融合、胚乳培養(yǎng)和花藥培養(yǎng)等途徑獲得三倍體葡萄品種。但在常規(guī)條件下，采用以上技術(shù)進(jìn)行品種間雜交存在較嚴(yán)重的雜交障礙，往往出現(xiàn)坐果率低、雜種胚早期敗育、親和力差、胚乳解體或獲得三倍體雜交種子生活力較低等問題，獲得雜交后代比較困難［1-3］，使用胚挽救技術(shù)可提高其雜種后代的成活率［4］。

自1982年Ramming等［5］首次報道了利用胚挽救技術(shù)培養(yǎng)無核葡萄胚珠并獲得2株實生苗以來，無核葡萄胚挽救開始引起世界各國葡萄育種者的關(guān)注［6-18］。Yamashita等［4，19-20］首先利用有核四倍體葡萄和二倍體葡萄雜交，經(jīng)胚珠培養(yǎng)，最高成苗率達(dá)42.4%，并成功獲得了三倍體植株。徐海英等［21］通過胚挽救獲得部分雜種苗，其中約23%為三倍體單株。潘春云等［22］利用胚挽救技術(shù)獲得三倍體植株，成苗率為0～5.3%。郭印山等［23］以葡萄二倍體與四倍體進(jìn)行胚挽救得到三倍體植株（27.59%）。此外，李世誠等、趙艷華等、石艷等、程琳琳等［24-27］也都通過胚挽救培育出了三倍體葡萄。

在多倍體葡萄育種方面，日本已培育成功的三倍體無核葡萄品種有：尾玲（Yileyi）、戴拉王（King Dela）、蜜無核（Honey Seedless）、甲斐美領(lǐng)（Kai Mirei）、夏黑（Summer Black），我國選育成功的三倍體無核品種—無核早紅（Earlyred Seedless）［28］。但是，由于現(xiàn)在對無核性狀的遺傳規(guī)律認(rèn)識還不夠深入，三倍體葡萄胚挽救育種技術(shù)尚不成熟，其胚挽救中胚的發(fā)育率、萌發(fā)率和成苗率較低仍是困擾三倍體胚挽救育種的一個難題。作者通過查閱了相關(guān)的資料，對三倍體葡萄胚挽救技術(shù)研究的進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，系統(tǒng)研究雜交組合的親本選擇、接種時期、培養(yǎng)基種類及馴化移栽方式對胚培養(yǎng)效果的影響等，以達(dá)到提高三倍體葡萄雜交胚萌發(fā)率和成苗率的目的。

1　三倍體葡萄胚挽救育種

1.1三倍體葡萄胚挽救育種影響因素

1.1.1親本選擇

胚挽救技術(shù)可大大縮短育種周期［4］，提高后代中無核雜種的比率［5］，可以阻止三倍體雜交幼胚的早期敗育，形成三倍體植株。而雜交組合的基因型不同，其胚挽救的成功率也將不同。

（1）母本的選擇——以二倍體葡萄為母本。在無核葡萄胚挽救過程中，選擇適宜的母本是雜交組合的關(guān)鍵。不宜采用可挽救性差的品種，如喜樂［24］、玫瑰露［1］、愛莫無核［27］等成苗率低于6%，不宜做母本。趙艷華等［29］以玫瑰香×巨峰的雜交胚珠為試材進(jìn)行胚挽救研究，成苗率最高為36%。而閆愛玲等［30］以玫瑰香×京優(yōu)雜交，成苗率為24.57%、秋紅×峰后雜交成苗率為35.32%。Flame Seedless［31］、Sweet Scarlet［31］、無核白［31］、無核紅寶石［23］等也是成苗率較高的品種，適宜用作母本。

（2）父本的選擇——以二倍體葡萄為父本。在無核葡萄胚挽救育種中，父本基因型對雜種成苗也有一定影響［32-33］，基因型差異導(dǎo)致親本親和力的不同［34］。山下裕之等［4］利用四倍體葡萄和二倍體有核葡萄雜交，經(jīng)過胚珠培養(yǎng)最高成苗率可達(dá)42.4%。而且，四倍體葡萄為母本比二倍體為母本獲得的后代三倍體的比例高，但是二倍體為母本要比四倍體為母本的胚發(fā)育率明顯提高［19］。郭印山等［35］研究了有核葡萄二倍體與四倍體正交、反交的親和力大小，結(jié)果顯示正交的親和力大于反交的，但是雜交后代三倍體的比例卻低于反交的。楊德龍等［36］通過研究也得到同樣的結(jié)果。

1.1.2接種時期

最佳接種時期的確定是胚挽救成功的關(guān)鍵因素［37-42］之一。最佳接種時期是胚發(fā)育程度最高而尚未達(dá)到敗育的時期，在此時進(jìn)行胚培養(yǎng)可以獲得最多數(shù)量的萌發(fā)苗［43］。張利等［16］研究證明了無核葡萄胚珠發(fā)育過程中存在一個急劇敗育期的推測，以及最適胚挽救時期與漿果開始軟化期作為接種最佳時期的研究基本一致［44］。

但目前，還沒有一個確定最佳接種時期的適用方法，大多數(shù)學(xué)者采用開花后天數(shù)作為接種時期的指標(biāo)，間接地反映胚珠內(nèi)胚的發(fā)育程度。不同品種間幼胚發(fā)育的進(jìn)程存在差異，因此胚挽救的最佳接種時期不同。以四倍體玫瑰香為母本的胚珠萌發(fā)率分別在花后65 d和70 d最高［35］。無核白為母本的雜交胚珠在授粉后35 d接種發(fā)育率最高；巨峰為母本的雜交胚珠在授粉后55 d發(fā)育率最大［45］，過早或過晚取樣均導(dǎo)致成苗率降低。取樣時期的確定與母本的成熟期有很大關(guān)系，母本相同的雜交組合最佳取樣時期相差不大。徐海英等［21］研究發(fā)現(xiàn)，早熟品種為授粉后6～9周，中熟品種為授粉后7～10周，晚熟品種為授粉后9～12周。但在實際應(yīng)用中，要考慮具體的環(huán)境條件、地理位置及氣候條件，同一品種在不同年份的最佳取樣時期也不盡相同。

1.1.3培養(yǎng)基

篩選適宜的培養(yǎng)基是獲得無核葡萄胚挽救成功的關(guān)鍵因素［32］。胚挽救過程可分為3個階段：胚珠內(nèi)胚發(fā)育階段，使胚珠充分發(fā)育成萌發(fā)力較強(qiáng)的胚；胚萌發(fā)階段，促使幼胚萌發(fā)；成苗階段，使已萌發(fā)的胚發(fā)育成正常植株。不同階段所選用的基本培養(yǎng)基類型和所需營養(yǎng)物質(zhì)不同。

（1）基本培養(yǎng)基。采用的基本培養(yǎng)基種類主要有Nitsch［54］、White、ER［27，35，38，46，47，52，54-57］、B5［48］、1/2MS、MS［24，49］、MM4［50］、NN［7，32］等。自Emershed和Ramming利用ER培養(yǎng)基用于胚珠發(fā)育并取得良好效果以來，Nitsch或ER作為無核葡萄胚珠發(fā)育基本培養(yǎng)基獲得了良好效果，而胚萌發(fā)和成苗培養(yǎng)基選用1/2MS或1/2B5較好［24，51］。郭印山等［53］認(rèn)為二倍體與四倍體雜交胚在無機(jī)鹽濃度較低的White培養(yǎng)基上更有利于其發(fā)育。在試驗過程中，對于不同雜交組合，應(yīng)進(jìn)行多次重復(fù)試驗，以找出適合的相應(yīng)培養(yǎng)基類型，提高胚挽救成功率。

（2）添加物。多數(shù)研究者認(rèn)為，在培養(yǎng)基中添加適宜的外源激素對胚的發(fā)育及萌發(fā)有促進(jìn)作用［6，57-59］。如在Nitsch培養(yǎng)基中添加IAA和GA3，對提高無核葡萄胚珠發(fā)育率起到關(guān)鍵作用［60］；IBA能促進(jìn)幼胚萌發(fā)［56，61］；在MM1培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加甘氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸和脯氨酸有利于胚的發(fā)育和成苗［62］等。劉佳等［63］在胚珠發(fā)育階段，使用ER+1.5 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3培養(yǎng)基最適宜離體幼胚的發(fā)育；在胚萌發(fā)階段，使用WPM+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L 6-BA +0.5 mg/L GA3培養(yǎng)基萌發(fā)率最高。激素的添加對胚發(fā)育率及成苗率也有一定的促進(jìn)作用［64］。但是在唐冬梅等［54］的研究中，在ER培養(yǎng)基中添加IAA和GA3將抑制胚珠發(fā)育。在基本培養(yǎng)基中適當(dāng)加入活性炭可防止?jié){果類胚珠培養(yǎng)出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，使用濃度通常在0.1%～0.3%之間。

1.1.4培養(yǎng)條件

（1）光照。在三倍體葡萄胚挽救過程，多數(shù)學(xué)者在培養(yǎng)階段會提供適宜的光照，光質(zhì)對根芽分化、葉綠體形成等都有影響。自1955年Capite最早將光因子應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)調(diào)控以來，有關(guān)光質(zhì)在植物離體培養(yǎng)中的作用研究也越來越多［66］。一般光周期為12～16 h，光照強(qiáng)度2000 lux。蘇小玲［66］研究了不同光質(zhì)對葡萄試管苗生長的影響，結(jié)合光質(zhì)對幼胚和試管苗生長的影響，考慮不同光質(zhì)對無核葡萄胚挽救成苗率的影響，開展相關(guān)的研究。而唐冬梅等［67］研究發(fā)現(xiàn)黑暗條件下有利于胚珠的發(fā)育，可能因為暗培養(yǎng)刺激了內(nèi)源激素的分泌［68］。

（2）溫度。在胚挽救過程中，溫度可以決定呼吸速度和控制植物組織代謝過程。最適溫度范圍為23～28 ℃之間。大多數(shù)研究者在胚挽救過程采用的是恒溫培養(yǎng)，溫度一般控制在（25±2） ℃，也有人認(rèn)為在低溫條件在對胚發(fā)育和萌發(fā)有著促進(jìn)作用，Gray等［7］、Spiegle等［60］認(rèn)為胚萌發(fā)需要低溫的狀態(tài)。蔣愛麗等［69］認(rèn)為，大小不同的胚珠在胚珠培養(yǎng)階段，幼胚對低溫的反應(yīng)不同，在培養(yǎng)“大敗育型”胚珠時，因為胚已經(jīng)進(jìn)入休眠，低溫處理同時附加BA，胚的萌發(fā)率最高。低溫處理一般針對的是成熟種子的萌發(fā)，低溫可打破種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)。而對于從正生長發(fā)育的果實中獲得的胚珠來說，是否需要經(jīng)低溫處理打破休眠目前值得探討和研究［70-71］。

（3）濕度。培養(yǎng)過程中適宜濕度對胚挽救成功與否也很重要，在無核葡萄胚挽救培養(yǎng)的三個階段中，胚珠生長對濕度的要求有所不同，王躍進(jìn)等［72］創(chuàng)建的無核葡萄胚挽救技術(shù)體系中建議胚珠接種在固液雙相培養(yǎng)基中，先把離體胚珠接種在固體培養(yǎng)基中，然后再倒入一定量的液體培養(yǎng)基，用量以蓋住整個胚珠為宜，這對于保持離體胚珠生長的濕度環(huán)境有很大作用，胚珠內(nèi)胚的發(fā)育率較高。此外，培養(yǎng)基的pH值對胚的生長有明顯影響，不同品種所需pH值不同。

1.2三倍體葡萄的鑒定

1.2.1體細(xì)胞染色體計數(shù)

關(guān)于二倍體與四倍體葡萄雜交幼苗染色體倍性鑒定方法的研究，染色體計數(shù)法是最直接、最傳統(tǒng)、最準(zhǔn)確的方法。現(xiàn)有研究表明，可以利用染色體計數(shù)法對通過胚挽救技術(shù)獲得的部分雜種苗進(jìn)行鑒定［21，23，30］。

1.2.2流式細(xì)胞儀鑒定

由于葡萄染色體數(shù)目較多（2n=38），對染色體計數(shù)操作復(fù)雜且費時費力，目前快速有效地鑒別果樹染色體倍性的方法是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定［65］，它可以直接測定細(xì)胞內(nèi)的DNA含量［73-74］，從而鑒別植株的染色體倍性水平，而且利用此方法的取材部位不受限制［25］。利用流式細(xì)胞儀對試管苗的細(xì)胞內(nèi)DNA的相對含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明，隨著植株倍性水平的增加，DNA的相對含量也隨之成倍增加［25，31，75］。采用流式細(xì)胞儀快速全面地進(jìn)行半定量分析后，初步篩選出三倍體單株，再進(jìn)一步通過染色體計數(shù)法加以直觀驗證，可較為系統(tǒng)地對獲得的雜種后代進(jìn)行倍性的早期鑒定。

1.2.3形態(tài)學(xué)鑒定

多倍體一般表現(xiàn)葉片肥厚、果粒較大、葉色濃綠、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞變大、枝干較粗、花較大。如三倍體葡萄一般生長旺盛，年生長量大，果實無核和少核［76-78］。有的花而不稔［24］。從組織發(fā)生學(xué)的角度看，氣孔大小、保衛(wèi)細(xì)胞大小和其內(nèi)葉綠體數(shù)由分生組織的LI層衍生而來［79-81］，與倍性呈正相關(guān)關(guān)系，而氣孔密度與倍性呈負(fù)相關(guān)?；ǚ哿Ｊ怯蒐II層衍生胞原組織形成［79-81］，花粉粒大小與染色體的數(shù)目呈正相關(guān)，四倍體花粉粒覆蓋層粗糙、穴狀雕紋的深度與二倍體親本有明顯的不同［82］。利用形態(tài)學(xué)鑒定法可獲得可靠的結(jié)果，但須進(jìn)行重復(fù)試驗，并且對果實種子是否無核的鑒定要等到開花結(jié)果才可以進(jìn)行，鑒定周期長，工作量大，并且極易受自然環(huán)境的影響［83］。

1.2.4分子輔助標(biāo)記鑒定

利用分子標(biāo)記輔助選擇，可以直接在DNA水平上進(jìn)行分析［84］，從而提高葡萄遺傳育種效率，并可用于雜種后代早期鑒定。利用RAPD標(biāo)記F1代的性狀進(jìn)行早期鑒定，淘汰有核雜種［85，90］，也可以進(jìn)行抗病性輔助選擇［39］和鑒定葡萄的無核性狀［89］與果實重量［88］。AFLP技術(shù)也可對突變體進(jìn)行早期鑒定［86］。王躍進(jìn)等［87］利用葡萄無核基因DNA探針對無核葡萄品種進(jìn)行檢測，并初步應(yīng)用于輔助育種。與形態(tài)學(xué)鑒定法相比，分子輔助標(biāo)記法不僅可以提高選擇的準(zhǔn)確率，而且不必等到植株開花結(jié)果，在幼苗時期就可以進(jìn)行［91］，但需要分子引物，試驗過程比流式細(xì)胞儀復(fù)雜。

1.3影響馴化移栽的因素

較多報道只是涉及實驗室試管育苗的結(jié)果，而關(guān)于試管苗的馴化移栽的研究較少。葡萄胚挽救苗馴化移栽的過程是一個由半異養(yǎng)到自養(yǎng)、高濕到低濕、恒溫到變溫、無菌到有菌的過程［92-94］，試管苗的生理特性和組織結(jié)構(gòu)與大氣環(huán)境中生長的植株有較大差別，如葉表面角質(zhì)層較薄，氣孔開度大且無開閉功能，柵欄組織發(fā)育不完善，細(xì)胞間隙較大等，因此，煉苗移栽時易過度失水萎蔫，移栽成活率普遍較低，甚至不能成活［95-96］。若要獲得較高的移栽成活率，需要馴化移栽過程中的各環(huán)節(jié)達(dá)到最佳搭配。

1.3.1基質(zhì)類型

合理配制移栽基質(zhì)是影響試管苗馴化移栽成活的關(guān)鍵因素，任杰等［97］試驗表明，采用基質(zhì)分層技術(shù)（即上層選用孔隙度大、透氣好的蛭石或珍珠巖，下層選用保墑性能好的田間土）進(jìn)行移栽，胚挽救苗的成活率顯著高于使用單種特定基質(zhì)。李玉玲等［98］以椰糠作為移栽基質(zhì)的組成部分，其可改善透氣性，促進(jìn)根系毛根的生長，能顯著提高葡萄胚挽救苗的成活率。紀(jì)薇等［99］認(rèn)為珍珠巖∶草炭∶園土=4∶1∶1作為基質(zhì)的移栽效果較好。

1.3.2生根粉濃度

蘸取一定濃度的生根粉溶液可以提高馴化移栽的成活率。王剛等［84］認(rèn)為1.0 mg/L生根粉溶液浸泡根系3 min，植株各項生理指標(biāo)較好且成活率最高。紀(jì)薇等［100］研究結(jié)果表明，蘸取濃度為200 mg/kg的生根粉（ABT10）30 s+培養(yǎng)室煉苗15 d+溫室煉苗15 d的移栽方式較好。

2　展望

培育大粒、無核、優(yōu)良抗性的三倍體葡萄是葡萄育種的主要目標(biāo)之一，利用胚挽救技術(shù)將葡萄二倍體與四倍體的雜交胚進(jìn)行離體培養(yǎng)，大大縮短育種年限且極大地提高了三倍體葡萄的育種效率。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展和研究的不斷深入，胚挽救技術(shù)結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)將會大大提高葡萄品種的選育效率。天津市農(nóng)科院葡萄研究中心利用分子生物技術(shù)和田間選種結(jié)合的方法從天津漢沽種植的茶淀玫瑰香葡萄中鑒別篩選出的玫瑰香優(yōu)系葡萄，較普通葡萄香氣濃郁，以此為親本，利用胚挽救可選育優(yōu)質(zhì)的三倍體葡萄，該項技術(shù)也會日趨成熟和完善。

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10.13414/j.cnki.zwpp.2016.05.038

2016-07-21

天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長基金（15010）。

路鳳珍（1990-），女，在讀研究生，研究方向葡萄遺傳育種。

田淑芬（1966-），女，博士，研究員，主要從事葡萄栽培與選育種方面的研究。E-mail： tianshufen@263.net