□ 陳燕銀 華測檢測認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司

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現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在食品和藥品微生物檢測中的應(yīng)用

□ 陳燕銀 華測檢測認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司

在我國藥品、食品行業(yè)急速發(fā)展的社會(huì)形勢下，食品、藥品的質(zhì)量與人們生命健康息息相關(guān)，然而我國當(dāng)前使用的食品、藥品檢測手段還不夠先進(jìn)，因此，發(fā)展一項(xiàng)新的食品、藥品檢測技術(shù)具有現(xiàn)實(shí)性。本文首先詳細(xì)分析了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的原理、應(yīng)用及前景，接著簡要介紹了變性梯度凝膠電泳技術(shù)、基因芯片和現(xiàn)代免疫技術(shù)。

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)主要由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、變性梯度凝膠電泳技術(shù)、基因芯片技術(shù)及現(xiàn)代免疫技術(shù)組成，這些技術(shù)隨著生物學(xué)家們對(duì)DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)的探索及對(duì)基因和染色體的研究逐漸發(fā)展而成熟，克服了傳統(tǒng)食品、藥品檢測技術(shù)靈敏性差、成本高等缺點(diǎn)，從而在食品和藥品檢測等方面的應(yīng)用逐漸增加。

現(xiàn)代各項(xiàng)分子生物學(xué)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）實(shí)質(zhì)上可以視為DNA的體外復(fù)制。這項(xiàng)技術(shù)可以將微量的DNA進(jìn)行大量擴(kuò)增，然后根據(jù)其基因和染色體確定該微生物的基因型，因此，被廣泛用于食品及藥品等微生物檢測領(lǐng)域。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的基本原理是在體外高速擴(kuò)增特定DNA分子片段。在高溫等外界條件滿足的情況下，先解旋雙鏈DNA，使它變成單鏈，然后再稍微降低溫度，在DNA聚合酶的作用下與引物進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，形成新的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。合成的新雙鏈結(jié)構(gòu)又可以繼續(xù)作為擴(kuò)增時(shí)的模板，再給予合適的溫度環(huán)境，按照上述步驟可以進(jìn)行無限擴(kuò)增。該項(xiàng)技術(shù)的重點(diǎn)是對(duì)溫度嚴(yán)格控制。雖然用PCR技術(shù)檢測食品和藥品中致病微生物的方法與傳統(tǒng)方法相比有靈敏度高、特異性強(qiáng)、時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但它同樣有許多問題。PCR所需要的合成引物需要極高的技術(shù)，這種技術(shù)很難推廣。由于PCR技術(shù)的高靈敏性，常會(huì)出現(xiàn)誤把微量外源污染的DNA當(dāng)作有害微生物的情況，會(huì)造成假陽性后果。而且PCR技術(shù)對(duì)溫度有較高要求，一旦外界環(huán)境不適宜，或者DNA序列選取不合適，就可能會(huì)使引物突變或靈敏度降低。熒光PCR技術(shù)雖然能解決準(zhǔn)確度不高和假陽性問題，但該技術(shù)價(jià)格昂貴，難以普及。因此，如何使PCR技術(shù)和其他技術(shù)相結(jié)合，取長補(bǔ)短，是未來食品和藥品檢測的發(fā)展方向。

變性梯度凝膠電泳技術(shù)

該技術(shù)的基本原理是DNA在濃度不一樣的變性劑中連接程度會(huì)不同，從而會(huì)產(chǎn)生不一樣的電泳遷移率，根據(jù)電泳遷移率的不同，可以分離堿基組成不一致的DNA片段。這項(xiàng)技術(shù)可以與DNA測序技術(shù)聯(lián)合使用，來分析食品與藥品的菌落組成成分。變性梯度凝膠電泳技術(shù)能探究微生物種群的多樣性和動(dòng)態(tài)活性，使人類研究自然生物群落有了新的方向，然而這項(xiàng)技術(shù)還是存在著局限性，它還不能對(duì)微生物的數(shù)目及代謝活性進(jìn)行檢測。

基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)的基本原理是與已知序列、固定標(biāo)記了的DNA探針進(jìn)行雜交，然后再進(jìn)行核苷酸測序，從而對(duì)樣品進(jìn)行檢測和分析。這項(xiàng)技術(shù)集化學(xué)、物理、計(jì)算機(jī)學(xué)科于一體，是一項(xiàng)高度交叉的新型技術(shù)，目前被廣泛應(yīng)用于篩選檢測藥物、尋找新基因、檢測微生物以及臨床診斷。該技術(shù)具有多樣性、并行性、自動(dòng)性和微型化，并且可以同時(shí)在同一片芯片上檢測出眾多種類的生物分子。雖然至今為止基因芯片技術(shù)還沒有被用于食品、藥品檢測，但其在檢測蛋白質(zhì)和分析基因表達(dá)等方面成效顯著。

現(xiàn)代免疫技術(shù)

作為食品、藥品衛(wèi)生檢測的主要方法之一，免疫技術(shù)以其價(jià)格低廉、操作方便、實(shí)用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)已在食品、藥品檢測中普遍使用。李斯特氏菌、沙門氏菌及大腸桿菌等常見的具有污染性的病原菌都能使用現(xiàn)代免疫技術(shù)檢測。目前，高速發(fā)展的免疫學(xué)新型技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)相比，增加了放射免疫測試、熒光免疫測試、酶免疫測試、免疫磁性分離及免疫傳感器測試等技術(shù)。

各項(xiàng)現(xiàn)代分子技術(shù)的應(yīng)用

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在食品、藥品檢測中的應(yīng)用

1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應(yīng)用

現(xiàn)代基因技術(shù)的發(fā)展使得人們?nèi)粘Ｉ钪谐霈F(xiàn)了各種各樣的轉(zhuǎn)基因食品，這些轉(zhuǎn)基因食品大多含有新的蛋白質(zhì)和DNA，因此，轉(zhuǎn)基因食品的安全需要進(jìn)行專業(yè)檢驗(yàn)才能使消費(fèi)者放心大膽購買。主流的轉(zhuǎn)基因食品檢驗(yàn)方法有PCR檢測法、蛋白質(zhì)檢測法、蛋白酶活性檢測法。在這些方法中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)是最安全有效的，因?yàn)槠渚哂胁煌谄渌麅煞N方法的優(yōu)點(diǎn)，蛋白質(zhì)和酶主要成分都是蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)易變性失活，不適用于專業(yè)檢驗(yàn)。Q- PCR技術(shù)是一種敏感度高、特異性強(qiáng)、靈活度高的技術(shù)，能檢測出超低含量的轉(zhuǎn)基因成分。熒光定量技術(shù)是另一種新型PCR技術(shù)，該技術(shù)加入了一種熒光基因，這種熒光信號(hào)會(huì)被應(yīng)用于整個(gè)PCR檢測過程，成功解決了以往PCR檢測方法中存在的準(zhǔn)確度低和假陽性問題。

2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在致病食品微生物檢測中的應(yīng)用

食品致病微生物主要有單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌、肉毒梭菌、沙門氏菌和弧菌等，PCR技術(shù)檢測這類致病微生物時(shí)，具有迅速、敏感等特性，是傳統(tǒng)方法無法做到的。單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌是牛奶等食品中主要的病原菌，用裂解法提取食品中的DNA，再用半套式PCR技術(shù)檢測，特殊合成的引物可對(duì)其進(jìn)行特異性擴(kuò)增，而且不會(huì)對(duì)其他菌類產(chǎn)生反應(yīng)。這種半套式PCR技術(shù)檢測限度在10個(gè)UFC以下，敏感性比傳統(tǒng)PCR技術(shù)高，檢測時(shí)間也比傳統(tǒng)方法短，僅需五六個(gè)小時(shí)。肉毒梭菌最易使肉類致病，傳統(tǒng)方法提取肉毒梭菌需要很多天，而選擇檢測肉毒神經(jīng)霉素的基因序列，合成特定的引物用來同時(shí)復(fù)制A、B、E、F型毒素的基因，雖然該種方法可以加快檢測速度，但是PCR只能用來檢測肉毒梭菌是否存在，而無法判斷有菌無毒或霉素與菌并存的狀態(tài)，因此，PCR對(duì)肉毒梭菌的檢測只能作為參考。副溶血弧菌主要分布于鹽湖及海洋微生物區(qū)，常見于水產(chǎn)品中，用PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測，比傳統(tǒng)方法更便捷、靈敏、迅速，而且具有高準(zhǔn)確性和可靠性。沙門氏菌是動(dòng)物體內(nèi)的一種腸道菌，它是導(dǎo)致人們食物中毒的罪魁禍?zhǔn)字?。基本上所有沙門氏菌都有與入侵相關(guān)的DNA，所以PCR技術(shù)檢測沙門氏菌具有超高靈敏度。

3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在藥品檢測中的應(yīng)用

藥品中主要用到的是PCR的實(shí)時(shí)熒光技術(shù)，該技術(shù)可以比傳統(tǒng)技術(shù)更迅速、更準(zhǔn)確地檢測到藥品中有害的金黃色葡萄球菌等。

變性梯度凝膠電泳技術(shù)在微生物檢測中的應(yīng)用

變性梯度凝膠技術(shù)主要應(yīng)用于檢測食源性致病菌和菌落變化。構(gòu)建與優(yōu)化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和變性梯度凝膠技術(shù)，再結(jié)合DNA測序技術(shù)，能分析出不同地區(qū)川芎內(nèi)含真菌的差異性，這樣就能得出川芎種群系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的多樣性以及環(huán)境對(duì)川芎的各方面影響。

現(xiàn)代免疫技術(shù)在食品、藥品檢測中的應(yīng)用

免疫吸附技術(shù)可以測定乳制品中的lgG含量。分離食品中的李斯特氏菌可以進(jìn)行免疫磁性分離，再與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相結(jié)合，建立一種新的酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法。這種方法能排除聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中雜菌、食品基質(zhì)、培養(yǎng)基組成成分等因素干擾，且具有迅速、準(zhǔn)確、敏感性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，成功解決了兩種方法單獨(dú)使用時(shí)會(huì)出現(xiàn)的問題。除此之外，現(xiàn)代免疫技術(shù)也可用抗原-抗體反應(yīng)檢測赤潮霉素中毒素的類型和含量。

結(jié)語

安全是日常生活中最受關(guān)注的問題，所以食品、藥品的安全檢測技術(shù)需要準(zhǔn)確、迅速、靈敏地檢測出其中含有的致病微生物，傳統(tǒng)檢測方法雖然能基本滿足檢測條件，但其有高成本、低效率等缺點(diǎn)，難以廣泛應(yīng)用。如果能與其他技術(shù)相結(jié)合，克服聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的假陽性等問題，產(chǎn)生的新技術(shù)將成為未來食品、藥品的主要檢測手段。