張海英 李偉 周龍龍 姜林 周銘心

摘要：目的 建立新疆阿魏乙酸乙酯部位質(zhì)量控制方法。方法 采用高效液相色譜法測(cè)定新疆阿魏乙酸乙酯部位的阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C含量。色譜柱為Waters XTerra RPC18（250 mm×4.6 mm，5 ?m），以乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)324 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 ?L。結(jié)果 阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C分別在0.05～1.0、0.132～2.64、0.118～2.36 mg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，平均回收率分別為99.34%、98.96%、99.24%。新疆阿魏乙酸乙酯部位的阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C含量分別為33.4、76.5、72.3 mg/g。結(jié)論 該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可為新疆阿魏乙酸乙酯部位的質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞：新疆阿魏；乙酸乙酯部位；阿魏酸；法尼斯淝醇A；法尼斯淝醇C；質(zhì)量控制

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.022

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）04-0083-04

Study on Quality Control of Ethyl-acetate Parts of Ferula Sinkiangensis ZHANG Hai-ying1， LI Wei1， ZHOU Long-long2， JIANG Lin1， ZHOU Ming-xin2 （1. Affiliated TCM Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China； 2. Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China）

Abstract： Objective To establish the method for quality control of ethyl-acetate parts of Ferula sinkiangesis. Methods HPLC was used to detect the contents of ferulic acid， farnesiferol A and farnesiferol C. Waters XTerra RPC18 column （250 mm×4.6 mm， 5 ?m） was used； acetonitrile-0.1% phosphoric acid was as mobile phase with gradient elution； flow rate was 1.0 mL/min； detective wavelength was 324 nm； temperature was 30 ℃； sample volume was 10 ?L Results Ferulic acid， farnesiferol A， and farnesiferol C showed a good linear relationship range from 0.05– 1.0 mg/mL， 0.132–2.64 mg/mL， and 0.118–2.36 mg/mL， respectively. The average recovery rates were 99.34%， 98.96% and 99.24% respectively. The contents of ferulic acid， farnesiferol A and farnesiferol C were 33.4， 76.5， 72.3 mg/g respectively. Conclusion The method was simple， accurate and repeatable， with good repeatability and stability， which can be used for the quality control of ethyl-acetate parts of Ferula sinkiangesis.

Key words： Ferula sinkiangesis； ethyl-acetate part； ferulic acid； farnesiferol A； farnesiferol C； quality control

阿魏屬隸屬于傘形科前胡族，約有150余種，主要分布于地中海、中亞及其鄰邊地區(qū)，我國(guó)約有26種1變種[1]，主要分布于新疆。2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》收載的阿魏為傘形科植物新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.She或阜康阿魏Ferula fukanensis K.M.Shen的樹(shù)脂，味苦、辛，溫，歸脾、胃經(jīng)，具有消食、化癥、散痞、殺蟲(chóng)功效[2]。近年來(lái)，由于發(fā)現(xiàn)其具有植物雌激素作用和抗癌活性而倍受關(guān)注。新疆少數(shù)民族用其治療胃腸道腫瘤。國(guó)外研究表明阿魏同屬植物有明確的抗腫瘤作用[3-4]。本課題前期研究結(jié)果表明，新疆阿魏乙酸乙酯部位對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞有一定的抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用，表明新疆阿魏有抗腫瘤作用[5]。

本研究檢測(cè)的除阿魏酸外的特征成分法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C在阿魏屬的多個(gè)種如Ferula assafoetida、Ferula persica等均分離得到，且發(fā)現(xiàn)在抗癌方面具有很好的藥理活性。法尼斯淝醇A在劑量1 mg/kg能夠極大抑制小鼠肺癌細(xì)胞株移植的肺癌模型小鼠的癌細(xì)胞擴(kuò)散面積，還能通過(guò)影響血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）1和VEGFR2來(lái)抑制腫瘤的新生血管生成；能夠抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合成和刺激脂多糖與干擾素-γ，從而治療一些神經(jīng)性病變[6]。法尼斯淝醇C則對(duì)多耐耐藥腫瘤細(xì)胞有非常好的效果，能抑制耐藥腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)糖蛋白（p-gp）的運(yùn)輸功能，阻止p-gp將胞內(nèi)的抗腫瘤藥物排出胞外，在低濃度0.5 ?g/mL就能有效抑制多藥耐藥腫瘤細(xì)胞株MCF7/ADR的p-gp的運(yùn)輸功能[7]。可見(jiàn)，阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C可視為新疆阿魏發(fā)揮抗腫瘤作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。基于中藥多成分多靶點(diǎn)作用特點(diǎn)，本研究同時(shí)測(cè)定新疆阿魏乙酸乙酯部位中阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C含量，為進(jìn)一步完善新疆阿魏乙酸乙酯部位的質(zhì)量控制提供一定的參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

AL 204電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超聲波清洗機(jī)（200 W，40 kHz），昆山市超聲儀器有限公司；Direct-QTM5超純水儀，Millipore；微孔濾膜，上海半島實(shí)業(yè)有限公司凈化器材廠(chǎng)；無(wú)油真空泵，HP-01；高效液相色譜儀，Waters 2695，DAD檢測(cè)器。

阿魏藥材為傘形科植物新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.Shen的樹(shù)脂，購(gòu)于新疆伊犁，經(jīng)新疆伊犁州食品藥品檢驗(yàn)所檢驗(yàn)合格，批號(hào)20120004。

阿魏酸對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110773-201012；法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C對(duì)照品，沈陽(yáng)藥科大學(xué)制備，經(jīng)UV、NMR、MS、IR鑒定，HPLC純度不低于98%。色譜乙腈（美國(guó)Fisher Scientific），水為超純水，磷酸、乙酸乙酯、石油醚等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XTerra RPC18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸水為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫（0～25 min，15%～30%A；25～35 min，30%A；35～55 min，45%A；55～85 min，50%A～60A%）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：324 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 ?L[8-9]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C 5.02、13.22、11.84 mg于10 mL容量瓶，加甲醇超聲溶解后，定容，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取新疆阿魏400 g，用2000 mL石油醚（30～60 ℃）超聲提取40 min，控溫在40 ℃以下，提取2次，過(guò)濾，棄去石油醚，殘?jiān)鼡]盡石油醚后，用乙酸乙酯2000 mL超聲提取2次，每次30 min，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮，即得阿魏乙酸乙酯部位60.81 g。取阿魏乙酸乙酯部位0.20 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL容量瓶中，加適量甲醇，超聲提取20 min，再用甲醇定容，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按上述色譜條件，分別精密吸取阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL，分別進(jìn)樣。在100～400 nm范圍內(nèi)，3種對(duì)照品及供試品的紫外-可見(jiàn)光譜均在324 nm處有最大吸收，由此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為324 nm。在所選擇的色譜條件下，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，且與其他成分分離度良好。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

阿魏酸對(duì)照品以甲醇為溶劑配制0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL的系列溶液，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣分析，在0.05～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，得線(xiàn)性方程Y=4 084 578X+10 468，r=0.999 6。

法尼斯淝醇A對(duì)照品以甲醇為溶劑配制0.132、0.264、0.528、1.056、2.112、2.64 mg/mL的系列溶液，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣分析，在0.132～2.64 mg/mL范圍內(nèi)，得線(xiàn)性方程Y=19 876 178X+490 60，r=0.999 4。

法尼斯淝醇C對(duì)照品以甲醇為溶劑配制0.118、0.236、0.472、0.944、1.888、2.36 mg/mL的系列溶液，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣分析，在0.118～2.36 mg/mL范圍內(nèi)，得線(xiàn)性方程Y=21 292 276X-570 646，r=0.999 5。

2.5 精密度試驗(yàn)

分別取法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C、阿魏酸對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜峰，計(jì)算3種對(duì)照品峰面積的RSD分別為1.24%、0.98%、1.12%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24、48 h檢測(cè)，記錄色譜峰，計(jì)算法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C、阿魏酸峰面積的RSD分別為1.56%、1.47%、1.23%，結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次阿魏乙酸乙酯部位提取物，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖和峰面積，計(jì)算法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C、阿魏酸峰面積的RSD分別為1.79%、1.17%、1.58%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取阿魏乙酸乙酯部位約0.1 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL錐形瓶中，制作6份，加入阿魏酸4.137 5 mg、法尼斯淝醇A 7.153 4 mg、法尼斯淝醇C 6.953 4 mg，加適量甲醇，超聲提取20 min，用甲醇定容，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，按上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)得阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C平均回收率分別為99.34%、98.96%、99.24%，RSD分別為1.83%、2.12%、1.35%，符合回收率要求，見(jiàn)表1。

2.9 樣品含量測(cè)定

精密稱(chēng)取阿魏乙酸乙酯部位0.2 g，共3份，按供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件測(cè)定樣品含量，并取平均值。結(jié)果新疆阿魏乙酸乙酯部位中阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C含量分別為（33.4±0.3）、（76.5±1.4）、（72.3±0.6）mg/g。

3 討論

3.1 色譜峰光譜一致性檢測(cè)

應(yīng)用二級(jí)管陣列檢測(cè)器和色譜工作站，對(duì)樣品中法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C、阿魏酸和對(duì)照品進(jìn)行紫外-可見(jiàn)吸收光譜掃描，結(jié)果兩者紫外-可見(jiàn)吸收?qǐng)D譜基本一致。

3.2 色譜條件的考察

本試驗(yàn)比較了甲醇-水系統(tǒng)和乙腈-水系統(tǒng)，在使用甲醇-水系統(tǒng)時(shí)，雜質(zhì)較多，難以達(dá)到滿(mǎn)意的分離效果，故選擇紫外吸收較小的乙腈-水系統(tǒng)。流動(dòng)相中性的條件下，色譜峰分離度不好，嚴(yán)重拖尾，對(duì)0.05%、0.1%、0.15%不同濃度的磷酸溶液進(jìn)行了考察，結(jié)果使用0.1%磷酸能很好地抑制峰拖尾，且相對(duì)穩(wěn)定，所以流動(dòng)相最終確定為乙腈-0.1%磷酸溶液[10]。

3.3 提取方法的選擇

本試驗(yàn)對(duì)阿魏乙酸乙酯部位采用了回流提取與超聲提取，發(fā)現(xiàn)二者特征成分含量差異不大，但超聲提取簡(jiǎn)單、易行，故采用超聲提取法。在對(duì)超聲提取溶劑進(jìn)行篩選時(shí)，比較了甲醇-甲酸（95∶5）、乙醇及甲醇的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇提取的供試品溶液特征成分含量較高，因此采用甲醇為提取溶劑。對(duì)超聲提取時(shí)間也進(jìn)行了篩選，超聲30 min后，特征成分含量趨于穩(wěn)定，所以確定超聲時(shí)間為30 min。

3.4 含量測(cè)定結(jié)果的分析

在2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》收載的傘形科植物新疆阿魏Ferula sinkiangensis的質(zhì)量控制中，只有阿魏酸的薄層色譜鑒別，沒(méi)有成分的含量測(cè)定。本研究基于阿魏屬植物的特征成分阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C在阿魏屬的多個(gè)種如Ferula assafoetida、Ferula persica等均有分離得到，且在抗癌方面具有很好的藥理活性，委托沈陽(yáng)藥科大學(xué)制備了法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C的單體化合物，經(jīng)檢測(cè)，新疆阿魏乙酸乙酯部位法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C的含量均在6%～9%左右，含量較高，可作為新疆阿魏的主要特征有效成分及指標(biāo)性成分，對(duì)新疆阿魏抗癌研究的物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量控制以及新疆阿魏其他藥理藥效研究有著十分重要的意義。

對(duì)含多種有效成分的新疆阿魏乙酸乙酯部位來(lái)說(shuō)，只測(cè)定單一或幾種成分，不足以全面反映內(nèi)在質(zhì)量。本試驗(yàn)采用梯度洗脫的方法，同時(shí)測(cè)定3種有效成分的含量，所建立的方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可用于新疆阿魏乙酸乙酯部位的質(zhì)量評(píng)價(jià)，以保證其臨床用藥的有效性。

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（收稿日期：2015-05-20）

（修回日期：2015-06-09；編輯：陳靜）