黎婧怡，許莉軍，姜 艷，邱正慶，姚鳳霞，李文慧，肖新華，邢小平

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院1內(nèi)科2內(nèi)分泌科衛(wèi)生部內(nèi)分泌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

3兒科4臨床遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京100730

一例含葡萄糖-6-磷酸酶新突變的復(fù)合雜合突變致華人糖原累積癥Ia型的遺傳特點(diǎn)

黎婧怡1，許莉軍2，姜 艷2，邱正慶3，姚鳳霞4，李文慧2，肖新華2，邢小平2

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院1內(nèi)科2內(nèi)分泌科衛(wèi)生部內(nèi)分泌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

3兒科4臨床遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京100730

目的 探討1例糖原累積癥Ia型 (glycogen storage disease type Ia，GSD Ia)患者的臨床特點(diǎn)及遺傳機(jī)制。方法 詳細(xì)收集患者臨床資料，包括病史、體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。提取患者及其父母的外周血DNA，進(jìn)行葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基 (glucose-6-phosphatase catalytic subunit，G6PC)基因5個外顯子測序，對新突變進(jìn)行蛋白功能預(yù)測。結(jié)果 患者為27歲男性，有低血糖、高乳酸血癥、高尿酸血癥和高脂血癥的典型臨床表現(xiàn)，肝穿刺活檢支持GSD Ia?；颊逩6PC基因第2個外顯子檢測到c.248G＞A(p.R83H)錯義突變，第5個外顯子檢測到c.674T＞C(p.L225P)錯義突變，患者父親和母親分別是攜帶c.674T＞C(p.L225P)及c.248G＞A(p.R83H)突變的雜合子。采用Polyphen 2和SIFT軟件對新發(fā)現(xiàn)的c.674T＞C(p.L225P)突變蛋白功能進(jìn)行預(yù)測，提示為致病突變，可能損害葡萄糖-6-磷酸酶蛋白功能。結(jié)論 G6PC基因的復(fù)合雜合突變是本例GSD Ia患者的致病基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)G6PC基因新的致病突變，拓寬了華人GSD Ia的致病基因譜。

糖原累積癥;葡萄糖-6-磷酸酶;基因突變

Med J PUMCH，2016，7(4):264－268

糖原累積癥Ia型 (glycogen storage disease type Ia，GSD Ia)是一類常染色體隱性遺傳病，發(fā)病率為1/30萬～1/10萬，病理生理機(jī)制為葡萄糖-6-磷酸酶 (glucose-6-phosphatase，G6Pase)缺乏，肝糖原不能釋放葡萄糖，臨床表現(xiàn)為兒童早期即出現(xiàn)低血糖、高乳酸血癥、高尿酸血癥和高脂血癥，可出現(xiàn)生長發(fā)育落后和青春期延遲，由于糖原累積而致肝臟增大，大部分患者在20～30歲時發(fā)現(xiàn)肝腺瘤，可能轉(zhuǎn)化為肝癌［1］。該病診斷主要依靠肝臟穿刺酶學(xué)檢測及基因檢測，而葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基 (glucose-6-phosphatase catalytic subunit，G6PC)基因檢測因其創(chuàng)傷小、準(zhǔn)確率高等優(yōu)勢已成為診斷該病的最常用手段［2-3］。本研究通過對1例GSD Ia患者進(jìn)行臨床及遺傳學(xué)分析，探討該病的致病機(jī)制。

對象和方法

對象

北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科收治的1例男性GSD Ia患者，經(jīng)患者及其家屬同意并簽署知情同意書后，進(jìn)一步收集患者及其父母的外周血，提取基因組DNA進(jìn)行分析。

臨床資料收集

詳細(xì)收集患者的一般臨床資料，進(jìn)行體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查和腹部CT檢查。

基因分析方法

基因組DNA提取及擴(kuò)增:按酚-氯仿法提取DNA，5對引物如下［2］:外顯子1:5'-TCTGCTGACATCTTCCT-3'，5'-GCCTCTTTTCTTGCTGA-3';外顯子2:5'-GCATTCATTCAGTAACCC-3'， 5'-TCCACTCAGCTTCTGTCT-3';外顯子3:5'-CACCTTTACTCCATTCTC-3'，5'-GTGGTGTGTCAGCTACA-3';外顯子4:5'-GCCAGGCTCCAACATTT-3'，5'-GGAGAGAAACGGAATGG-3';外顯子5:5'-CTTCCTATCTCTCACAG-3'，5'-TCACTTGCTCCAAATACC-3'。50 μl PCR擴(kuò)增的反應(yīng)液中含有250～500 ng的基因組DNA，20 μmmol/L dNTP 4 μl，緩沖液5 μl，Taq DNA多聚酶0.5 μl，20 μmol/L引物2 μl，PCR條件為94℃變性60 s，57℃退火60 s，72℃延伸90 s，總循環(huán)30次，最終72℃延伸7 min。

純化測序:PCR純化采用MOBIO試劑盒，測序用美國AB公司的AB3130測序儀及配套的BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit。

家系分析:將患兒及父母的基因組DNA分別進(jìn)行擴(kuò)增、純化和直接測序。

DNA序列的突變分析:測序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心 (National Center for Biotechnology Information，NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)GeneBank數(shù)據(jù)庫及人類基因突變數(shù)據(jù)庫 (human gene mutation database，HGMD)中G6PC基因的基因組DNA、cDNA序列進(jìn)行比對。

蛋白功能評估:采用Polyphen-2(http://genetics. bwh.harvard.edu/pph2/) 和 SIFT軟件 (http://sift. jcvi.org/www/SIFT_BLink_submit.html)對突變的危害性進(jìn)行預(yù)測，以判斷該突變的致病性［4-5］。

結(jié)果

臨床資料

患者男性，27歲，因腹脹27年，鼻衄25年，關(guān)節(jié)疼痛8年入院?；颊叱錾鷷r腹部膨隆，嬰幼兒時期食量大，需頻繁喂食，爬行、說話及走路均晚于同齡兒。自20個月始間斷鼻衄，8歲時查B超示肝肋下7 cm?；颊咔宄炕蜻M(jìn)食少時偶有頭暈、乏力，無意識不清、暈厥發(fā)作，未測血糖，自行加餐。8年前出現(xiàn)多關(guān)節(jié)疼痛，后逐漸出現(xiàn)多發(fā)皮下結(jié)節(jié)，左膝關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)穿刺抽出尿酸鹽結(jié)晶。2006年肝穿刺活檢后診斷“糖原累積癥”，建議口服生玉米淀粉，但患者未堅(jiān)持。否認(rèn)遺傳性疾病家族史。入院查體:貧血貌，體重指數(shù)16 kg/m2，雙耳、雙手、雙前臂、雙肘、臀部、雙膝、雙足散在多發(fā)質(zhì)硬皮下結(jié)節(jié)，直徑0.5～2 cm。心肺未見異常，肝臟鎖中線肋緣下10 cm，劍下10.5 cm，壓痛、叩擊痛陽性。實(shí)驗(yàn)室檢查:血紅蛋白37 g/L，血糖3.0 mmol/L;乳酸6.2 mmol/L;尿酸893 μmol/L，甘油三酯 2.1 mmol/L;丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶7 U/L，白蛋白31 g/L，總膽紅素2.7 μmol/L，直接膽紅素1.5 μmol/L，肌酐54 μmol/L，血?dú)夥治?pH 7.335，堿剩余－5 mmol/L。腹部增強(qiáng)CT:肝臟多發(fā)占位，部分占位動脈期明顯強(qiáng)化 (圖1)。

圖1 患者腹部增強(qiáng)CT示肝臟多發(fā)實(shí)性占位

治療

給予生玉米淀粉70 g每日4次加水口服，低脂、低嘌呤膳食，每日主食約150 g，別嘌醇、碳酸氫鈉口服并輸血治療，治療10 d后，患者食量下降，精神改善，復(fù)查血紅蛋白51 g/L，血糖4.4 mmol/L，乳酸2.2 mmol/L，尿酸511 μmol/L，甘油三酯2.26 mmol/L;血?dú)夥治?pH 7.437，堿剩余3.3 mmol/L。

基因分析結(jié)果

PCR測序表明，患者G6PC基因第2個外顯子檢測到c.248G＞A(p.R83H)突變，第5個外顯子檢測到 c.674T＞C(p.L225P)突變，為復(fù)合雜合突變，患者父親和母親分別是攜帶 c.674T＞C(p.L225P)及c.248G＞A(p.R83H)突變的雜合子 (圖2)。經(jīng)查詢NCBI及HGMD數(shù)據(jù)庫，c.674T＞C(p.L225P)突變國內(nèi)外文獻(xiàn)未見報道。

G6Pase蛋白功能

對新突變c.674T＞C(p.L225P)采用Polyphen-2和SIFT軟件進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測值分別為0.999和0.001，表明該突變造成的結(jié)果為有害，可能導(dǎo)致G6Pase蛋白結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)一步證實(shí)c.674T＞C(p.L225P)突變是一種新的致病性突變。

圖2 患者及父母基因測序圖 (反向測序結(jié)果) A.患者G6PC基因外顯子5內(nèi)父源c.674T＞C(p.L225P)突變;B.患者G6PC基因外顯子2內(nèi)母源c.248G＞A(p.R83H)致病突變;C.患者母親G6PC基因外顯子5正常序列，外顯子2序列同圖B;D.患者父親G6PC基因外顯子2正常序列，外顯子5序列同圖A

討論

本例為青年男性，自幼起病，慢性病程，表現(xiàn)為腹部膨隆、肝大，反復(fù)鼻衄，多關(guān)節(jié)紅腫熱痛，皮下多發(fā)結(jié)節(jié);查體可見貧血貌，多關(guān)節(jié)腫大變形，皮下散在多發(fā)質(zhì)硬結(jié)節(jié)，肝大，肋緣下10 cm;檢驗(yàn)提示嚴(yán)重貧血、低血糖、高甘油三酯、高乳酸及高尿酸血癥。臨床符合糖原累積癥表現(xiàn)，并行肝臟穿刺活檢證實(shí)為GSD Ia。GSD Ia的起病與G6PC活性減低或缺失相關(guān)。G6PC為糖原合成及糖異生過程中的關(guān)鍵酶，GSD Ia患者因缺乏G6PC，糖原分解成6-磷酸葡萄糖后不能被水解為葡萄糖，從而導(dǎo)致嚴(yán)重低血糖，低血糖刺激分泌的胰高血糖素促使部分6-磷酸葡萄糖進(jìn)入糖酵解途徑，產(chǎn)生大量乳酸，部分6-磷酸葡萄糖進(jìn)入磷酸戊糖途徑，產(chǎn)生大量尿酸，部分患者可如本例一樣形成痛風(fēng)結(jié)節(jié)。此外，低血糖引起胰島素水平降低，脂肪代謝紊亂，產(chǎn)生高甘油三酯血癥［3］。GSD Ia患者長期處于低血糖狀態(tài)，并存在多種代謝紊亂，可出現(xiàn)生長發(fā)育落后及青春期延遲，且糖原累積而致肝臟增大，大部分患者在20～30歲時發(fā)現(xiàn)肝腺瘤，部分進(jìn)一步進(jìn)展為肝癌［1］。本例患者合并嚴(yán)重小細(xì)胞低色素性貧血，貧血為糖原累積癥的常見表現(xiàn)之一，多種因素可導(dǎo)致貧血的發(fā)生。首先，GSD Ia患者血小板功能的降低可增加出血風(fēng)險，長期慢性出血可表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素性貧血。其次，在合并肝腺瘤的GSD Ia患者中，鐵調(diào)素表達(dá)增加，鐵調(diào)素與巨噬細(xì)胞膜上的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1結(jié)合后促使后者內(nèi)吞降解，減少胞內(nèi)鐵向胞外轉(zhuǎn)移，從而引起鐵利用障礙;鐵調(diào)素介導(dǎo)的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)障礙通過抑制腸道重吸收鐵，加重貧血［6］;部分病例中，腺瘤切除或肝移植可改善貧血［7-8］。

GSD Ia為常染色體隱性遺傳病。Lei等［9］于1993年證實(shí)G6PC基因突變導(dǎo)致G6PC失活或活性降低，從而引起GSD Ia。G6PC基因定位于染色體17q21，全長12.5 kb，含有5個外顯子，編碼了一個由357個氨基酸組成，包含9個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的疏水蛋白［10］。G6PC的表達(dá)具有組織特異性，最主要的表達(dá)部位是肝臟、腎臟和腸道。在G6PC基因克隆之前，GSD Ia的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)及血液生化檢驗(yàn)，并且需要肝臟活檢來測定G6PC活性［1-2］，隨著對G6PC基因研究的逐漸深入，無創(chuàng)并且精確的基因檢測已逐步代替了傳統(tǒng)的肝臟活檢病理，因而明確突變基因?qū)τ诩膊〉脑\斷尤為重要。目前已經(jīng)報道85種以上的G6PC基因突變，其中，64%為錯義突變［1］。在華人中，c.648G＞T是最常見的突變，約占54%［11-12］。本例為復(fù)合雜合突變，其中一個雜合突變來自母親，發(fā)生在外顯子2上，c.248G＞A(p.R83H)突變已有報道，導(dǎo)致組氨酸代替了精氨酸，該突變在華人突變中的比例占26%［11］，純合的c.248G＞A(p.R83H)突變可造成G6PC活性的完全失活［9，11］。本例中另一雜合突變來自父親，發(fā)生在第5外顯子上，c.674T＞C (p.L225P)導(dǎo)致脯氨酸代替了賴氨酸，目前尚未見報道，突變位于G6Pase蛋白的跨膜區(qū)，易造成功能損害，采用 Polyphen-2及 SIFT軟件對 c.674T＞C (p.L225P)的預(yù)測支持該突變有害，且預(yù)測結(jié)果與臨床表現(xiàn)相符合，因此，筆者認(rèn)為c.674T＞C(p.L225P)是一種新的致病突變。GSD Ia患者臨床表現(xiàn)異質(zhì)性強(qiáng)，有文獻(xiàn)報道，部分基因型如c.648G＞T純合突變患者可無明顯低血糖表現(xiàn)［11］。本例患者呈重度貧血，而低血糖癥狀不明顯，考慮可能與患者基因型有一定關(guān)系。

GSD Ia的治療方面，日間多次少量進(jìn)食和進(jìn)食吸收慢的碳水化合物如生玉米淀粉的飲食治療是目前驗(yàn)證有效的唯一治療方式，其中口服生玉米淀粉最為常用，具體為每4～6 h口服生玉米淀粉混懸液 (約1.5～2 g/kg)，以維持血糖水平在3.6～4.7 mmol/L左右。需要監(jiān)測每天的能量攝入，攝入量少則不足以改善代謝狀況，攝入過多會導(dǎo)致高脂血癥、糖原負(fù)荷過重、肝大及肥胖［13］。若患者可保持血糖正常，高尿酸血癥、高乳酸血癥等代謝紊亂可被改善，肝腺瘤發(fā)生率也將減低，貧血可部分糾正，但高甘油三酯血癥仍可能存在［14］。輔助治療包括維生素、鈣劑、鐵劑的補(bǔ)充，口服別嘌醇治療高尿酸血癥。若出現(xiàn)尿微球蛋白，則應(yīng)予血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑預(yù)防腎臟并發(fā)癥［15］。

GSD Ia患者的早期診斷和長期規(guī)范治療能顯著改善疾病預(yù)后，維持正常血糖可以改善代謝異常和臨床癥狀，雖不能完全避免腎臟和肝臟損害的發(fā)生，但能夠顯著減少肝臟腺瘤的發(fā)生率［1］，而本例患者明確診斷時間較晚、未能堅(jiān)持治療是其早期就出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥的重要原因。因而提倡早期對疑似病例進(jìn)行無創(chuàng)性基因檢測，對于該病的及時診斷及規(guī)范治療尤為重要。

綜上，G6PC基因的復(fù)合雜合突變是本例GSD Ia患者的致病基礎(chǔ)，本研究發(fā)現(xiàn)G6PC基因新c.674T＞C (p.L225P)的致病突變，拓寬了華人GSD Ia的致病基因譜，提倡對此病早期診斷和規(guī)范治療。

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A Novel Compound Heterozygous Mutation in Glucose-6-Phosphatase Gene in a Chinese Patient with Glycogen Storage Disease Ia

LI Jing-yi1，XU Li-jun2，JIANG Yan2，QIU Zheng-qing3，YAO Feng-xia4，LI Wen-hui2，XIAO Xin-hua2，XING Xiao-ping2

1Department of Internal Medicine，2Department of Endocrinology，Key Laboratory of Endocrinology of Ministry of Health，
3Department of Paediatrics，4Laboratory of Clinical Genetics，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100730，China

JIANG Yan Tel:010-69155073，E-mail:sinojenny@126．com

Objective To analyze the clinical features and genetic mechanism of a Chinese glycogen storage disease type Ia(GSD Ia)patient．Methods Clinical features of the patient including medical history，physical examination and laboratory results were collected in detail．DNA was extracted from peripheral blood of the patient and his parents．Mutation analysis was performed for the five exons of glucose-6-phosphatase catalytic subunit(G6PC)gene using DNA sequencing，prediction of protein function was conducted for novel mutation．Results The patient was a 27-year-old male Chinese GSD with typical symptoms of hypoglycemia，hyperlactaci-demia，hyperuricemia and hyperlipidemia，and the diagnosis of GSD Ia was confirmed by liver biopsy．Missense mutations of c.248G＞A(p.R83H)in the second exon and c.674T＞C(p.L225P)in the fifth exon were detected in G6PC gene in this patient，which were separately carried in his mother and father，respectively．The pathogenicity of novel mutation c.674T＞C(p.L225P)was supported by Polyphen2 and SIFT software analysis，which showed that the mutation might damage the function of glucose-6-phosphatase protein．Conclusions The compound heterozygous mutation in G6PC gene causes GSD Ia in this patient．Our findings of the novel pathogenic mutation of G6PC gene expands the spectrum of G6PC gene mutations in Chinese．

glycogen storage disease;glucose-6-phosphatase;gene mutation

姜 艷 電話:010-69155073，E-mail:sinojenny@126．com

R589.1

A

1674-9081(2016)04-0264-05

10.3969/j.issn.1674-9081.2016.04.005

2015-09-30)

國家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目 (WBYZ 2011-873);北京協(xié)和醫(yī)院中青年基金 (PUMCH2013-019)